英文題目：Identifification of epilepsy-associated neuronal subtypes and gene expression underlying epileptogenesis

中文題目：鑒定癲癇相關(guān)的神經(jīng)元亞型和誘發(fā)癲癇的基因表達

發(fā)表時間：2020年10月7號

影響因子：12.121

研究背景

癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有自發(fā)性和反復(fù)發(fā)作的特征，其主要發(fā)生在海馬體或大腦皮層區(qū)域。人們對癲癇的病理生理學仍然知之甚少。雖然有一些動物模型研究顯示某些神經(jīng)元亞型對癲癇發(fā)作的產(chǎn)生和傳播有一定的促進作用，但在人類癲癇患者的相應(yīng)數(shù)據(jù)卻很少。這是由于癲癇發(fā)生過程中復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)現(xiàn)象。

實驗方法

10x snRNA-seq，Smart-seq2?snRNA-seq，RNA-seq，ISH等

結(jié)論

該項研究揭示了癲癇對神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄的不同影響—即雖然許多亞型表現(xiàn)出輕微的基因表達變化，但其對一些特定的SUB型主要神經(jīng)元和GABA能間神經(jīng)元產(chǎn)生了很大的影響。

結(jié)果

一、癲癇皮質(zhì)中與疾病相關(guān)的神經(jīng)元亞型

為了識別哪些神經(jīng)元亞型受癲癇影響或?qū)е掳d癇，文章中比較了來自癲癇性顳皮質(zhì)和非癲癇性顳皮質(zhì)的snRNASeq數(shù)據(jù)，研究結(jié)果表明，在一些位置，例如，皮層上層L2_Cux2_Lamp5和L2-3_Cux2_Frem3，在癲癇和非癲癇的皮層產(chǎn)生的神經(jīng)元之間存在明顯的轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)移(圖1a)。此外，盡管癲癇病和非癲癇病樣本中每個亞型的神經(jīng)元數(shù)量大致相似，但觀察到幾種亞型中已被鑒定的細胞核數(shù)量顯著減少(圖1b)。在癲癇患者中，L2/3亞型的數(shù)量減少了，當對每種情況下的序列神經(jīng)元總數(shù)進行歸一化時，這種減少更加明顯(圖1c)。對于中間神經(jīng)元，Pvalb_Sulf1亞型的神經(jīng)元數(shù)量減少較多(圖1c)。

通過基因表達相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)癲癇和非癲癇神經(jīng)亞型之間的巨大差異(圖1d)，這可能表明癲癇對其轉(zhuǎn)錄組有特定的影響。對于主要神經(jīng)元，L5-6_Fezf2_Tle4_Abo、L5-6_Themis_Ntng2、L2_
Cux2_Lamp5和L2-3_Cux2_Frem3亞型在癲癇和非癲癇皮質(zhì)中轉(zhuǎn)錄組差異大(圖1d)。對于gaba能間神經(jīng)元，在癲癇發(fā)作的顳葉皮層中，Vip_Cbln1、Sst_Tac1、Pvalb_Sulf1、Pvalb_Nos1和Id2_Lamp5_Nos1的轉(zhuǎn)錄組改變大。同時也證實了癲癇相關(guān)DE基因在具有較大轉(zhuǎn)錄組差異的神經(jīng)元亞型中普遍存在(圖1e、f)。

圖1癲癇和非癲癇數(shù)據(jù)集的整合和疾病相關(guān)神經(jīng)元亞型的鑒定

二、共有和亞型特異性癲癇相關(guān)途徑

作者計算了每種已鑒定亞型GO中DE基因的富集程度，一些神經(jīng)元亞型在癲癇中表現(xiàn)出了大的轉(zhuǎn)錄組改變(>100豐富的GO)，但多數(shù)神經(jīng)元亞型中只有少數(shù)GO，特別是對于生物過程(BP)來說，這應(yīng)該與通路的生物學功能相關(guān)(圖2a)。這些受影響較小的亞型中，大多數(shù)在癲癇細胞和非癲癇細胞之間也具有高的基因表達相關(guān)性(圖1d)，從而證實癲癇和非癲癇之間轉(zhuǎn)錄組相關(guān)性高的亞型中，癲癇改變的信號通路也較少。

根據(jù)GO分析，發(fā)現(xiàn)一些Sst亞型、Vip_Cbln1和Id2_Lamp5亞型顯示DO高度富集，如局灶性癲癇(DOID:2234)、癲癇綜合征(DOID:1826)和顳葉癲癇(DOID:3328)。此外，還發(fā)在L3_Cux2_Prss12、L5-6_Fezf2_Lrrk1_Sema3e和L5-6_Fezf2_Tle4_Abo主要神經(jīng)元亞型中富集的與癲癇相關(guān)的DO相同。這表明，與癲癇相關(guān)的DO在不同的神經(jīng)元亞型中富集差異很大，與谷氨酰胺能細胞相比，在GABAergic和Sst亞型Vip_Cbln1和Id2_Lamp5中，癲癇相關(guān)的DO在GABAergic和Sst亞型Vip_Cbln1和Id2_Lamp5中富集更廣泛，顯示出對癲癇的特殊易感性。

圖2神經(jīng)元亞型中癲癇相關(guān)通路和轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)移的鑒定

三、癲癇活動的信號通路

谷氨酸受體，尤其是AMPA受體被證明是癲癇發(fā)作的主要驅(qū)動力之一，在篩選出缺乏表達的基因后，尋找富含與奮性相關(guān)轉(zhuǎn)錄組學變化的亞型，并從這些GO項中繪制DE基因（圖3a–d）。CKAMP44是貫穿整個顳葉皮質(zhì)的主要AMPA受體輔助亞基，這一事實也強調(diào)了CKAMP44上調(diào)的重要性(圖3c, d)。癲癇對AMPA受體輔助亞基編碼基因的上調(diào)有相當普遍的影響。

多種谷氨酸受體亞基和神經(jīng)元活性相關(guān)基因表達復(fù)雜失調(diào)，其中大部分在癲癇中未見報道。因此,雖然大多數(shù)的基因編碼谷氨酸受體亞基表達上調(diào)(GRIA1、GRIA3 GRIA4, GRIK3, GRIK4, GRIK5, GRIN2B, GRIN3A, GRM1, GRM7,和GRM8),但一些是表達下調(diào)(GRIA2、GRIA3 GRIN2A, GRM5, GRIK1,和GRIK2)(圖3?b, c)。

圖3鑒別可能導(dǎo)致癲癇發(fā)作的皮層神經(jīng)元亞型的信號通路和基因

癲癇患者皮層谷氨酸介導(dǎo)興奮相關(guān)基因顯著分層上調(diào)或下調(diào)。作者用單分子熒光原位雜交(smFISH)方法標記了幾個高度調(diào)控基因的mRNA。如上所述，在主要神經(jīng)元的亞型中，編碼AMPA輔助亞基的許多基因分層上調(diào)。因此，在一組癲癇和非癲癇樣本的皮質(zhì)切片中標記了CKAMP44 mRNA，通過與Rorb和DAPI共標記，并確定了L2/3、L4和L5/6的位置(圖4b)。重要的是，證實了各層中CKAMP44的表達顯著上調(diào)(圖4b)。

圖4癲癇患者皮層谷氨酸介導(dǎo)興奮相關(guān)基因的復(fù)雜分層失調(diào)

四、受癲癇影響的基因網(wǎng)絡(luò)

在癲癇樣本中，六個與癲癇密切相關(guān)的模塊上調(diào)，六個下調(diào)。另外，在細胞水平分析中突出的幾個涉及過度興奮信號和癲癇發(fā)作的基因也是一個或多個癲癇相關(guān)基因模塊的成員。編碼谷氨酸受體亞基的基因也廣泛存在于癲癇相關(guān)模塊中。這些基因共表達分析捕獲了主要神經(jīng)元L5-6_Fezf2_Tle4_Abo和L2-3_Cux2亞型中活躍的核心轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。與癲癇狀態(tài)相關(guān)的基因模塊指向與突觸和離子通道相關(guān)的轉(zhuǎn)錄變化，包括AMPA受體輔助亞基、谷氨酸受體亞基和電壓門控鈉通道，這些可能與癲癇回路異常高的興奮有關(guān)。同時觀察到主要神經(jīng)元和GABAergic間神經(jīng)元的受影響的亞型根據(jù)豐富的GO項的相似性聚集在一起(圖5b)。因此，L2-3_Cux2和L5-6_Fezf2亞型與Sst_Tac1和Vip_Cbln1亞型共聚，而L3_Cux2_Prss12亞型與Pvalb_Sulf1亞型共聚，這可能是癲癇轉(zhuǎn)錄組中受影響嚴重的局部神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)。

圖5綜合分析癲癇易受影響的神經(jīng)元亞型

結(jié)論

總之，該研究通過單核轉(zhuǎn)錄組測序（snRNA-seq）發(fā)現(xiàn)癲癇患者的神經(jīng)轉(zhuǎn)錄組發(fā)生了大規(guī)模而復(fù)雜的變化，其中一些亞型表現(xiàn)出了明顯的癲癇驅(qū)動的基因表達異常，而其他亞型則大部分未受影響。癲癇相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組改變可以聚集成包含多個神經(jīng)元亞型的模塊，這些神經(jīng)元亞型可能是受癲癇影響的不同神經(jīng)元聚集的基礎(chǔ)。未來需要在小鼠模型和人類組織中進行轉(zhuǎn)化研究，以解決哪些已確定的通路導(dǎo)致癲癇的產(chǎn)生和傳播，以及哪些更能代表神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)態(tài)可塑性。

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本次我們給大家?guī)韮善脝渭毎D(zhuǎn)錄組技術(shù)助力動物細胞圖譜繪制的高分文章解讀，希望能給老師后續(xù)的研究提供思路。

動物細胞圖譜分析繪制案例：黑腹果蠅

中文標題：果蠅細胞圖譜：成年果蠅的單核轉(zhuǎn)錄組圖譜

英文標題：Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly

期刊：Science[IF: 63.714] 2022.3.4

DOI：10.1126/science.abk2432

實驗設(shè)計

實驗材料：黑腹果蠅

實驗方法：解剖了來自雌性和雄性黑腹果蠅的12個組織（觸角、體壁、脂肪體、平衡棒、心臟、腸道、腿、馬氏管、絳色細胞、喙和下顎須、氣管、翅膀）以及3個性別特異性組織（雄性生殖腺、睪丸、卵巢）。對于遍布全身的組織使用特異性GAL4驅(qū)動核-GFP蛋白，再用流式細胞熒光分選技術(shù)標記和收集細胞核，進行單細胞核snRNA-seq

測序策略：單細胞核轉(zhuǎn)錄組10x Genomics、Smart-seq2

研究內(nèi)容

黑腹果蠅在生物學研究方面有著豐富的歷史，以往研究探索了其不同組織中的表達模式，但缺乏細胞類型分辨率級別的數(shù)據(jù)庫。近年來單細胞技術(shù)的進步使得同時對數(shù)千個細胞進行轉(zhuǎn)錄組分析成為可能，促進了全組織細胞圖譜的創(chuàng)建。然而，現(xiàn)有scRNA-seq數(shù)據(jù)集來自不同實驗室，是基于不同遺傳背景，不同分離方法以及不同測序平臺產(chǎn)生的，阻礙了跨細胞和組織的基因表達的系統(tǒng)性分析。

該研究通過對果蠅多組織進行單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序后，得到了果蠅細胞圖譜。之后對15個組織進行詳細的細胞注釋，在果蠅頭部，注釋到了81種主要的神經(jīng)細胞類型，在果蠅的軀體中注釋了最豐富的33種細胞類型。該圖譜還可用于進行相同細胞的跨組織分析，作者通過分析血細胞在整個組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)了血細胞中最常見的細胞類型——漿細胞，并未在成蟲血細胞中觀察到葉狀血細胞。通過對肌肉細胞在不同組織類型進行比較，發(fā)現(xiàn)它們主要在果蠅軀體、體壁和腿部有特定的富集，并發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟肌、骨骼肌、間接飛行肌的分離。

通過轉(zhuǎn)錄因子分析，找到了500個轉(zhuǎn)錄因子和細胞類型具有高特異性，繪制了每種細胞類型中特異轉(zhuǎn)錄因子的表達熱圖。此外，作者還使用SCENIC預(yù)測了基于共表達和motif富集的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過對廣泛細胞類型或組織的基因進行比較分析，發(fā)現(xiàn)了在各種細胞類型中的常見表達基因和特定表達基因。

通過對性別依賴的基因表達和性別特異性組織分析，發(fā)現(xiàn)體細胞中的主要性別決定基因doublesex（dsx）的表達在很大程度上不具有性別特異性，而許多其他基因的表達具有性別依賴。作者進一步對精母細胞和精細胞進行軌跡推斷，發(fā)現(xiàn)精母細胞期被轉(zhuǎn)錄的基因數(shù)量持續(xù)增加，許多強烈上調(diào)的基因在任何其他細胞類型中都沒有基本表達。然而，晚期精母細胞顯示了來自許多其他細胞類型的標記基因的表達。

果蠅細胞圖譜：成年果蠅的單核轉(zhuǎn)錄組圖譜

動物細胞圖譜分析繪制案例：食蟹猴

中文標題：食蟹猴單細胞轉(zhuǎn)錄組和調(diào)控組參考圖譜

英文標題：A reference single-cell regulomic and transcriptomic map of cynomolgus monkeys

期刊：Nature comuiations?[IF: 17.694]?2022.07.13

DOI：10.1038/s41467-022-31770-x

實驗設(shè)計

實驗材料：成年食蟹猴

實驗方法：選取16個器官（心、肝、脾、肺、腎、胃、結(jié)腸、肌肉、氣管、主動脈、脂肪、膀胱、舌頭、乳腺、子宮和睪丸）

測序策略：10x Genomics單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）和單細胞染色質(zhì)開放性測序（scATAC-seq）

研究內(nèi)容

非人類靈長類動物（Non-human primates）在系統(tǒng)發(fā)育上與人類非常接近，在遺傳、器官發(fā)育、生理功能、病理反應(yīng)和生化代謝等諸多方面表現(xiàn)出與人類相似的特征，是生物醫(yī)學研究和藥物開發(fā)的理想實驗動物模型。其中，最為典型的代表當屬食蟹猴。系統(tǒng)評估食蟹猴等非人靈長類動物模型與人類的細胞組成差異、器官異質(zhì)性和基因表達時空特異性等在基礎(chǔ)研究中具有十分重要的價值。

該研究對成年食蟹猴的16個代表性器官進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序和單細胞染色質(zhì)開放性測序，構(gòu)建了食蟹猴多器官的單細胞多組學參考圖譜，將25萬個細胞進行 t-SNE降維聚類得到40余種不同的細胞亞群。

通過對該細胞圖譜進行分析，鑒定到了新的細胞類型。為了解析上皮細胞異質(zhì)性，作者提取上皮細胞并進行亞群聚類分析。根據(jù)marker基因的獨特表達模式，分析鑒定出14個上皮細胞簇，包括基底細胞、分泌細胞、纖毛細胞和非纖毛細胞。纖毛上皮細胞在各種組織中都占很大比例，為了探索纖毛上皮細胞亞型的發(fā)育和功能動態(tài)，作者選用纖毛上皮細胞相對較多的器官，使用Monocle和RNA速度分析對纖毛上皮細胞進行軌跡分析，觀察到纖毛細胞從祖細胞狀態(tài)向成熟狀態(tài)分化的過程，沿著擬時間高表達的基因在與代謝過程、細胞對刺激的反應(yīng)和防御反應(yīng)相關(guān)的基因本體(GO)術(shù)語中順序富集。

使用CellPhoneDB細胞通訊分析，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞、上皮細胞和髓系細胞之間存在強烈的細胞間相互作用。通常，細胞間相互作用的強度和模式是器官特異性的。為了重新繪制調(diào)節(jié)細胞-細胞相互作用的分子相互作用，作者在不同器官的特定細胞亞群中繪制了配體-受體對，揭示了猴子各種器官細胞間通信的潛在分子機制。

結(jié)合表達譜和染色質(zhì)開放性數(shù)據(jù)，作者分析預(yù)測了控制不同細胞類型基因表達模式的關(guān)鍵調(diào)控子。發(fā)現(xiàn)SPIB、POU2F2、SPI1、CEBPD和IRF4是髓系細胞中的關(guān)鍵調(diào)控子；而FEV具有調(diào)節(jié)造血干細胞的潛能，該轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與對免疫細胞和上皮細胞的基因表達調(diào)控。大多數(shù)順式調(diào)控元件(CREs或ATAC峰)來自啟動子、內(nèi)含子或遠端基因間調(diào)控區(qū)。在scATAC-seq數(shù)據(jù)中預(yù)測了9種細胞類型，在RNA簇中發(fā)現(xiàn)了兩種罕見的細胞類型，單核細胞和循環(huán)B細胞，但在ATAC簇中沒有發(fā)現(xiàn)?？傊?，本文中的scATAC-seq數(shù)據(jù)為無偏見地發(fā)現(xiàn)食蟹猴的細胞類型和調(diào)控DNA元件提供了豐富的資源。

最后，作者進行了跨物種比較分析，通過整合分析器官匹配的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，探討了人、食蟹猴和小鼠三個物種之間的細胞組成和基因表達特異性。猴子和人類在同源基因表達方面表現(xiàn)出明顯高于其他比較的細胞類型相似性。其中，免疫細胞相較于非免疫細胞，人類和猴子之間的基因表達具有更高的相似性。間質(zhì)細胞在人鼠和猴鼠比較中表現(xiàn)出最高的相似性。這些發(fā)現(xiàn)表明，猴子在免疫系統(tǒng)中與人類具有高度相似的轉(zhuǎn)錄程序，因此可能為研究對癌癥或新冠病毒COVID-19等疾病的免疫反應(yīng)提供理想的模型。

食蟹猴多器官單細胞多組學參考圖譜構(gòu)建與分析

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