Ps:李順昌教授團隊多次合作利用轉錄組測序全面精準揭示糖尿病相關發(fā)病機制和治療策略，其實驗方案設計值得大家借鑒參考。
研究背景
心臟重構和功能障礙是糖尿病常見的并發(fā)癥，常導致嚴重的心血管事件。MOTS-c是一種線粒體衍生肽，通過加速葡萄糖攝取和提高胰島素敏感性來調節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)。目前發(fā)現(xiàn)，MOTS-c不僅可改善心臟與血管內皮功能，且其含量在糖尿病患者血漿中明顯下降，使其成為糖尿病心血管并發(fā)癥的一個新的治療靶點。所以，該研究旨在探究MOTS-c對糖尿病心臟結構與功能的影響并利用轉錄組學技術挖掘其中的分子機制。
材料方法
對照組（C，n?= 10）和糖尿病前組（PD，n?= 30）。PD組的大鼠服用含有67%正常顆粒、10%豬油、20%蔗糖、2%膽固醇和1%膽酸鈉（16）的高脂肪飲食7周，糖尿病大鼠被隨機分為兩組：（1）糖尿病組（未經(jīng)治療）（D），（2）用MOTS-c（M）治療的糖尿病大鼠，取對照組（C）、未治療組（D）、治療組（M）大鼠心臟組織，進行轉錄組測序（RNA-seq）。
研究思路
研究結果
1. MOTS-c顯著降低糖尿病空腹血糖與胰島素抵抗
MOTS-c治療8周后，D組和M組大鼠體重低于C組（圖1a和圖1e）。與D組相比，M組大鼠空腹血糖水平降低（圖1b）。此外，與C組相比，D組和M組大鼠胰島素水平下降，D組和M組間胰島素水平無顯著差異（圖1c）。通過計算HOMA-IR指數(shù)評估胰島素抵抗。與C組相比，D組大鼠的HOMA-IR指數(shù)顯著升高，而M組大鼠HOMA-IR指數(shù)較D組降低。
圖1. MOTS-c干預后各組大鼠空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR與體重的變化
2. MOTS-c有效改善糖尿病心臟結構和功能
該研究利用透射電鏡測定了MOTS-c對糖尿病心肌超微結構的影響。糖尿病引起心肌纖維排列紊亂和線粒體結構的異常改變，包括心肌細胞排列不規(guī)則、嵴破裂、腫脹和空泡化（圖2）。MOTS-c治療糖尿病大鼠顯著降低心肌線粒體損傷，改善心肌纖維和線粒體結構（圖2）。研究還通過測定檸檬酸合酶的活性，測定了線粒體功能。D組大鼠檸檬酸合酶的活性顯著降低，C組和M組的檸檬酸合酶的活性無統(tǒng)計學差異（圖3g）。
使用M型超聲心動圖測定大鼠心臟功能。D組大鼠LVPWd值明顯升高，提示左心室出現(xiàn)病變（圖3d）。與C組相比，D組大鼠EF值下降（圖3b），提示糖尿病對照組大鼠心臟收縮功能受損。D組糖尿病大鼠的E峰值和A峰值均下降，而A峰值下降更快，因此增加了E/A比值（圖3c、3e和3f）。M組和C組在EF、E/A、LVPWd、E峰值和A峰值方面均無差異（圖3b-3f），表明MOTS-c心臟舒張功能和收縮功能。
圖2. 各組大鼠心肌組織透射電鏡圖像
圖3. 各組大鼠超聲心動圖影像與數(shù)據(jù)統(tǒng)計
3. 差異表達基因的篩選
為了進一步探究糖尿病大鼠對MOTS-c的適應性反應的機制，研究者利用RNA-Seq技術，測定了心肌組織基因全長轉錄表達。以C組為對照，D組表現(xiàn)出的差異表達基因（DEGs）即致病基因，再以D組為對照組篩選出M組的差異表達基因，二者篩選出的DEGs中重疊的基因即為MOTS-c改變的致病基因。將以上步驟執(zhí)行，篩選出47個MOTS-c改變的致病基因（圖4a）。將這47個基因進行熱圖分析后發(fā)現(xiàn)，C組基因表達趨勢與D組相反，而與M組近似（圖4b）。
圖4. 差異表達基因的篩選
4.差異表達基因的功能富集分析
采用Gene Ontology（GO）與Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）對MOTS-c所改變的47個致病基因進行功能富集分析。GO 注釋系統(tǒng)包含三個主要分支，即：生物學過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組分（CC）。）8 周 MOTS-c 注射所改變的 47 個糖尿病致病基因共富集于 195 個 GO term 中，其中 188 個 term 富集于 BP，2 個 term 富集于 CC，5 個 term 富集于MF。經(jīng)過 ClueGO 聚類分析后，195 個 term 主要富集于 9 個類別（見圖 5b），分別為血管生成（angiogenesis）、凋亡過程調控（regulation of the apoptotic process）、MAPK 級聯(lián)調控（regulation of MAPK cascade）、蛋白激酶活性正調控（positive regulation of protein kinase activity）、脂肪酸代謝過程（fatty acid metabolic process）、吞噬作用調節(jié)（regulation of phagocytosis）、蛋白激酶 B 信號正調控（positive regulation of protein kinase B signaling）、ERK1/2 級聯(lián)（regulation of ERK1/2 cascade）、膠質生成（gliogenesis）和白細胞介素-1 的產(chǎn)生（interleukin-1 beta production）。KEGG通路富集分析顯示，18條KEGG通路顯著富集（圖5b），其中5條信號通路與免疫、凋亡和糖代謝相關（ErbB信號通路、補體和凝血級聯(lián)、c型凝集素受體信號通路、PI3K-Akt信號通路和AGE-RAGE信號通路）。在功能富集通路注釋基因中，ALOX15、ATF3、CCN1、EGR1、EGR3、ERRFI1、THBS1、TLR2和NRG1高頻率注釋。CCN1與EGR1基因高表達，同時均注釋在凋亡相關的GO term中，而CCN1也注釋于富集顯著性最高的ERK1/2級聯(lián)通路中，表明CCN1、ERK1/2與EGR1可能是相互關聯(lián)的關鍵基因。
圖5. GO與KEGG功能富集分析
5. MOTS-c對CCN1 / ERK1/2 / EGR1信號通路的影響
為了驗證CCN1、ERK1/2與EGR1是否在MOTS-c改善糖尿病心臟結構與功能中發(fā)揮重要作用，也為了進一步探究MOTS-c對線粒體發(fā)生的作用，研究者利用RT-PCR與Western Blotting技術測定了CCN1、ERK1/2、EGR1的基因表達與蛋白表達以及線粒體發(fā)生標志蛋白PGC-1α的蛋白表達。結果表明，MOTS-c治療后，糖尿病大鼠心肌中PGC-1α蛋白表達顯著上升（圖7a）；CCN1、ERK1/2和EGR1基因表達顯著降低（圖6）；CCN1、EGR1蛋白表達顯著降低，ERK1/2的總蛋白表達量不變（圖7），但多個研究表明MOTS-c僅影響ERK1/2的磷酸化水平。
圖6. 各組大鼠心肌中CCN1、ERK1/2與EGR1的基因表達和蛋白表達
研究結論
為期8周的MOTS-c治療減少了糖尿病患者的心功能障礙與線粒體損傷，MOTS-c可能是通過調節(jié)脂肪酸代謝、免疫調節(jié)、血管生成和細胞凋亡產(chǎn)生作用。CCN1/ERK1/2/EGR1的信號轉導可能在MOTS-c抑制心肌細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。
參考文獻
Manda Wang, Gangqiang Wang, Shunchang Li, et al. MOTS-c repairs myocardial damage by inhibiting the CCN1/ERK1/2/EGR1 pathway in diabetic rats. Front. Nutr., 04 January 2023Sec.
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1、所有基因挖掘
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2、差異基因挖掘
差異基因挖掘是基于差異基因篩選，實現(xiàn)不同分組間差異表達基因的比較、功能注釋和通路富集分析等，解析參與生物學過程的關鍵基因及其功能。
3、表達量挖掘
表達量挖掘可以根據(jù)各個基因的表達量，實現(xiàn)不同樣品中共同表達和特異表達的基因的篩選，如組織特有表達基因篩選、不同處理樣品間特異表達基因篩選、不同發(fā)育時期特異表達基因篩選等，并對特定基因進行后續(xù)功能分類分析，如聚類分析，表達模式分析等。
4、高級工具挖掘
高級工具挖掘主要是整合基因表達量與表型數(shù)據(jù)、互作信息、其他組學信息，進行基因共表達網(wǎng)絡（WGCNA）、蛋白互作網(wǎng)絡圖、組學聯(lián)合分析等，解析基礎代謝過程和轉錄調控網(wǎng)絡。
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英文標題：
Roles?of?different?active?metal-reducing?bacteria?in?arsenic?release?from?arsenic-contaminated?paddy?soil?amended?with?biochar.
發(fā)表時間：2017
期刊：Journal?of?hazardous?material
影響因子：6.51
合作單位：中國科學院廣州地球化學研究所??廣東省生態(tài)環(huán)境科學與技術研究院
研究背景
由于砷污染對世界范圍內的食品安全和人類健康造成的威脅，稻田砷污染越來越受到人們的關注。間歇性洪水和周期排水對稻田砷的影響顯著。特別是稻田的洪澇條件會導致砷As(III)的釋放，進而被水稻吸收。膳食大米已經(jīng)成為人體砷的主要來源，因此，了解缺氧水稻土壤中砷的釋放機制對砷污染稻田的修復意義重大。
生物炭是有機物在低氧條件下熱解產(chǎn)生的固體富碳物，近年來，因其在農(nóng)業(yè)和環(huán)境方面的效益而被廣泛關注。生物炭可以提高土壤固碳能力，改善土壤質量，提高作物產(chǎn)量。生物炭的pH值、吸附能力、表面積、陽離子交換能力和微孔體積較高，能夠去除土壤中的重金屬污染物。此外，生物炭也可以通過加強電子轉移來促進金屬反應。研究表明，生物炭修正引起砷(As)大量釋放的原因，主要是由微生物群落的轉移和鐵Fe(III)還原菌豐度的增加導致的。
在稻田中，砷的釋放與氧化鐵的氧化還原反應密切相關，金屬還原菌能夠通過金屬呼吸作用控制金屬污染物的轉移。簡單來說，排水后的稻田As(V)轉移率較低，這是因為Fe(III)氧化物可以高度吸附As(V)，限制了砷的轉移，然而洪澇爆發(fā)時，微生物介導的Fe(III)還原作用會將吸附的As(V)釋放到水中，同時，吸附和釋放的As(V)能夠被As(V)還原菌異化還原為As(III)。有些異化As(V)呼吸菌也是鐵還原菌（如Geobacter和Shewanella），它們可以同時釋放Fe(II)和As(III)。研究表明，生物炭修正后的砷污染水稻土壤中，梭菌（Clostridium）、芽孢桿菌（Bacillus）和喜熱菌屬（Caloramator）占主導地位，地桿菌（Geobacter）、
厭氧粘細菌（Anaeromyxobacter）、Desulfosporosinus和土地桿菌（Pedobacter）豐度也升高。目前，生物炭修飾對水稻土壤砷轉移的影響，以及對砷污染水稻土壤微生物群落的轉錄活性和功能的影響仍不清楚。16s rRNA測序和轉錄組定量被認為是描述活躍菌群和微生物活性的更好指標。
研究目的
本研究以受砷污染的水稻土壤為材料，采用生物炭進行厭氧微生物試驗。其目的在于：1. 通過監(jiān)測生物炭修正和無生物炭的微環(huán)境中砷和鐵形態(tài)的動態(tài)變化，評價生物炭修正對缺氧水稻土壤中的砷生物地球化學的潛在影響；2. 通過16S rRNA高通量測序技術，調查砷轉化過程中的活性菌群多樣性；3. 利用RT-qPCR定量分析主要的砷相關細菌的轉錄水平及潛在作用，進一步分析砷轉移與轉錄水平之間的相關性。
材料與方法
1. 土壤、生物炭和微環(huán)境
土壤樣品取自于汕頭市蓮花山鎢礦下游的砷污染稻田，運回實驗室后低溫保存；生物炭制備于產(chǎn)自馬來西亞的油棕纖維；：將水稻土壤與30℃去離子水共孵育3周，激活土壤微生物，消耗原生電子受體，模擬稻田的淹水環(huán)境；厭氧微環(huán)境試驗：120mL血清瓶，70mL培養(yǎng)液（30 mM PIPES緩沖液，pH 7.3），7g水稻土壤（濕重），氮氣隔離，1 mL/L微量元素溶液，1 mL/L維生素溶液，10 mM 乳酸，30℃靜置過夜；設置3個分組：3%（w/w）生物炭修正的水稻土壤、無生物炭修正的水稻土壤（對照組）、無菌土壤（對照組）（γ射線輻射處理）；每個采樣周期（第0、1、2、5、10和20天）采集3個微環(huán)境樣品，提取總RNA，檢測砷和鐵的形態(tài)變化。
2. 砷和鐵的形態(tài)變化
高效液相色譜結合氫化物發(fā)生原子熒光的方法(HPLC-HG-AFS)。
3. RNA提取和反轉錄
MoBio試劑盒提取土壤樣本的總RNA，Prime Script RT試劑盒（Takara）反轉錄為cDNA。
4. 活性微生物的菌群結構
16s rRNA V4（515R/806F），illumina PE250，QIIME 1.8.0，RDP數(shù)據(jù)庫。
5. 金屬還原相關菌的檢測
使用Geo494F/Geo825R、Chis150f/ClostIr、FAc12-66F/FAc12-432R和She120F/She220R這4對引物，分別對地桿菌（geobacter）、希瓦氏菌（Shewanella）、梭菌（clostridium）和厭氧粘細菌（Anaeromyxobacter）進行實時熒光定量PCR（RT-PCR），分析這4種金屬還原菌的豐度。
結果與分析
1. 砷和鐵的釋放
從圖1a和1b來看，生物炭修正的水稻缺氧土壤中，F(xiàn)e(III)的還原與As(V)的解吸或釋放均被促進，As(III)的濃度與Fe(II)的濃度密切相關，F(xiàn)e(III)和As(V)的降低是同時發(fā)生的；從圖1c來看，在整個孵育期間，無菌土壤中均未觀察到鐵和砷的明顯釋放，表明鐵和砷的降低是由微生物導致的。
?圖1. 不同孵育階段，生物炭修正（a）、無生物炭修正（b）和無菌（c）水稻土壤的釋放性砷As(III)/As(V)和鐵Fe(II)/Fe(III)的濃度。
2. 活性微生物的菌群結構
α-多樣性分析結果表明，水稻土壤的生物炭修正組、無生物炭修正和無菌組的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和物種數(shù)目均無顯著性的差異，表明生物炭修正對水稻土壤微生物菌群多樣性的影響微乎其微。在門水平，生物炭修正組和無生物炭修正組中厚壁菌門（firmicutes）的豐度差異可能與生物炭有關（圖2）；在屬水平，生物炭修正提高了水稻土壤中的地桿菌（Geobacter）、厭氧粘細菌（Anaeromyxobacter）和梭菌（clostridium）的豐度（圖3），這3種菌均與砷、鐵的還原有關。
圖2. 生物炭修正（a）、無生物炭修正（b）水稻土壤的“門”和“綱”水平活性微生物的相對豐度。
圖3. 生物炭修正（a）、無生物炭修正（b）水稻土壤的“屬”水平活性微生物的相對豐度差異比較（“*”號表示p＜0.05。
3. 金屬還原菌的轉錄水平活性
在生物炭修正組中，地桿菌（geobacter）相對轉錄豐度顯著高于對照組（無生物炭修正組）（圖4a），表明生物炭顯著提高了水稻土壤中地桿菌（geobacter）的轉錄活性。此外，生物炭對孵育初期的厭氧粘細菌（Anaeromyxobacter）和希瓦氏菌（Shewanella）的轉錄也有積極影響，然而抑制了對菌（clostridium）的轉錄水平（圖4b-d）。
在生物炭修正組中，地桿菌（geobacter）的轉錄水平與砷As(V)的釋放濃度顯著正相關（Pearson，R=0.98，p＜0.001；Spearman，R=1，p＜0.001），梭菌（clostridium）的轉錄水平與鐵Fe（III）的釋放濃度顯著負相關（Spearman，R = 0.829 ，P < 0.05）。由此可見，在生物炭修正的水稻土壤中，地桿菌（geobacter）和梭菌（clostridium）可以通過提高轉錄水平快速響應砷As(V) 和鐵Fe(III)的釋放。
圖4. 生物炭修正與無生物炭修正的水稻土壤的（a）：地桿菌（geobacter）；（b）梭菌（clostridium）；（c）厭氧粘細菌（Anaeromyxobacter）和（d）希瓦氏菌（Shewanella）的相對轉錄豐度。
表1. 地桿菌（Geobacter）、?梭菌（Clostridium）、厭氧粘細菌（Anaeromyxobacter）和希瓦氏菌（Shewanella）的相對轉錄水平與釋放砷As(V)和鐵Fe(III)的Pearson和Speraman相關性檢驗.
研究結論
本文以砷污染的水稻土為研究對象，通過構建厭氧微環(huán)境，探究生物炭存在下的砷轉移、活性菌群變化及它們的轉錄活性水平。結果表明，與對照相比，生物炭可以促進微生物對砷As(V)和鐵Fe(III)的還原，提高土壤溶液中的砷As(III)釋放。提取環(huán)境樣本中的總RNA研究微生物的群落結構，與對照組相比，生物炭提高了地桿菌（geobacter）、厭氧粘細菌（Anaeromyxobacter）和梭菌（clostridium）3種與砷、鐵相關的細菌。RT-PCR結果表明，生物炭顯著促進了地桿菌（geobacter）的轉錄水平。此外，在生物炭修正的微生境中，地桿菌（geobacter）的轉錄水平與砷As(V)含量，梭菌（clostridium）的轉錄水平與鐵Fe(III)含量均呈顯著的負相關性?？傊锾磕軌蛲ㄟ^促進金屬還原細菌的活性提高砷As轉移，地桿菌（geobacter）和梭菌（clostridium）分別能降低生物炭中的砷As(V)和鐵Fe(III)含量。
參考文獻：
Qiao?J?T?,?Li?X?M?,?Li?F?B?.?Roles?of?different?active?metal-reducing?bacteria?in?arsenic?release?from?arsenic-contaminated?paddy?soil?amended?with?biochar[J].?Journal?of?Hazardous?Materials,?2017:S0304389417308476.
Scientific Reports 2016
研究背景
水稻是最重要的糧食作物之一，在過去的50年里，通過雜交育種已經(jīng)大幅度提高了水稻的產(chǎn)量。然而雜交育種最近幾年也遇到了瓶頸，多倍體化則成為水稻育種的另一條思路。多倍體化能夠提高優(yōu)勢基因發(fā)生重組和相互作用的可能性，提高水稻對環(huán)境的適應能力。
同源四倍體水稻（autotetraploid rice）是二倍體水稻經(jīng)過染色體加倍形成的新種質。同源四倍體水稻亞種間雜種F1具有強大的生物學優(yōu)勢，蘊含著巨大的增產(chǎn)潛力，可望成為未來水稻育種的新途徑。然而，其雜種F1普遍存在育性偏低，產(chǎn)量優(yōu)勢難以發(fā)揮，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上難以直接應用的問題。所以，如何創(chuàng)制育性正常且能克服雜種F1不育性的新型四倍體（neo-tetraploid）是利用其優(yōu)勢的關鍵。
為了避免同源四倍體水稻育性偏低的問題，華南農(nóng)大某研究組經(jīng)過20年的努力，培育出2個新型四倍體水稻，其結實率可達80%以上，于2016年獲得國家植物新品種權。本研究旨在通過轉錄組測序，研究新型四倍體（Huaduo 3）與同源四倍體雜交F1代的花藥、子房和葉片的基因表達情況，為解析新型四倍體育性和雜種優(yōu)勢的分子機制打下基礎。
材料方法
新型四倍體水稻Huaduo 3（H3），40種不同的同源四倍體水稻，以及雜交F1代。同源四倍體水稻 Huajingxian 74-4x（T452）與H3的雜交F1代用于測序分析。
轉錄組測序：取T452，H3及雜交F1代的三種不同組織分別進行轉錄組測序，包括減數(shù)分裂階段的花藥、減數(shù)分裂階段的子房、開花階段的旗葉。每個組織每種品系有3個生物學重復，共27個樣品。測序平臺為Illumina HiSeq 2500，平均每個樣品測約5G。
小RNA測序：取T452，H3及雜交F1代的減數(shù)分裂階段的花藥進行小RNA測序，無生物學重復。
全基因組重測序：兩個親本T452和H3的葉片DNA用于全基因組重測序。
嗯，測序手段還是挺多滴！
技術路線
研究結果
1.新型四倍體水稻Huaduo 3（H3）的育種及其與其它四倍體水稻的雜交過程
將兩種同源四倍體水稻（Jackson-4x和96025）進行雜交，獲得F1代雜交種。F1代雜交種再進行連續(xù)自交，到F5代時發(fā)現(xiàn)一株水稻有80%的結實率，這株水稻經(jīng)過多代連續(xù)自交，到F10-F13代時出現(xiàn)可以穩(wěn)定遺傳的高結實率性狀，這個品系被命名為Huaduo 3（H3）。H3不僅結實率高，還有其它高產(chǎn)性狀（表1），其花粉母細胞有90%以上是正常的。
將H3與40種其它品系的同源四倍體水稻（26個印度種和14個日本種）進行雜交，獲得的40種F1代表現(xiàn)出了很多大大優(yōu)于親本的性狀，尤其是單株谷粒數(shù)、結實率、單株產(chǎn)量等性狀。為了進一步研究雜交F1代的雜種優(yōu)勢，我們挑選了T452和H3的雜交F1代進行轉錄組研究。T452是一種育性較低的同源四倍體，雜交F1代的高親優(yōu)勢幾乎都是正的，除了谷粒長度和10谷粒寬度兩個指標。雜交F1代的中親優(yōu)勢除了10谷粒寬度這一個指標以外都是正的，說明雜交F1代表現(xiàn)出了明顯的雜種優(yōu)勢。
高親優(yōu)勢（High-parent heterosis，HPH）是指雜交F1代的產(chǎn)量或者某一數(shù)量性狀的數(shù)值與高值親本（HP）同一性狀數(shù)值差值的比率。高親優(yōu)勢（%）=(F1-HP)/HP*100%。
中親優(yōu)勢（Mid-parent heterosis，MPH）指雜交F1代的產(chǎn)量或者某一數(shù)量性狀的數(shù)值與雙親（P1和P2）同一性狀的平均值差值的比率。中親優(yōu)勢（%）=[F1-(P1+P2)/2]/(P1+P2)/2*100%。
表一：T452與H3雜交F1代的雜種優(yōu)勢。HPH：高親優(yōu)勢；MPH中親優(yōu)勢；PH：植株高度；EP：單株谷粒數(shù)；FG：單花谷粒數(shù)；SS：結實率；GYP：單株產(chǎn)量；GL：10谷粒長度；GW：10谷粒寬度。
圖1：親本和雜交F1代的表型。（A）Jackson-4x（T45），Huaduo 3（H3）與96025（T44）的谷粒大小，H3是來自T45和T44的雜交；（B）H3在大田中的長勢；（C）T45，H3，T44的植物表型；（D）Shennong15-4x（T424），H3，以及兩者雜交F1代的表型。
2.轉錄組測序
因為T452和H3的雜交F1代表現(xiàn)出了優(yōu)良性狀，因此可以通過轉錄組測序研究性狀差異的原因。取T452，H3及雜交F1代的三種不同組織分別進行轉錄組測序，包括減數(shù)分裂階段的花藥、減數(shù)分裂階段的子房、開花階段的旗葉。總共測了548M clean reads，平均有89.06%的reads可以比對到參考基因組上，其中93.45%都是比對到唯一位置上。三個生物學重復之間的相關性都達到了0.8以上。用qRT-PCR的方法對12個差異表達基因（DEG）的表達量進行了驗證，結果與轉錄組測序的結果一致。對不同樣品進行層次聚類分析表明，相同組織的樣品總能聚到一塊（圖2）。
圖2：所有基因的層次聚類分析。AN：花藥；OV：子房；LE：葉片。
3.差異表達基因（DEG）分析及注釋
在三個不同株系中共發(fā)現(xiàn)17877個DEG，兩兩比較的DEG數(shù)目在1521到2498之間（表2）。F1和親本之間的DEG稱為DEGF，親本之間的DEG稱為DEGP。DEGF的基因能分為兩個不同的組，其中一個組在DEGP里面也有，另一個組只屬于DEGF，后者被稱為DEGFu。這些DEGFu基因能夠解釋F1和親本之間的表型差異，因此接下來的研究種重點關注DEGFu基因。在這17877個DEG里面，有1150，1014，1122個DEGFu與花藥、子房、葉片有關，其中分別有807，663，866個基因與花藥、子房、葉片特異相關，這些基因被稱為DEGFu-sp。
表2：三個不同組織中的差異表達基因統(tǒng)計。AN：花藥；OV：子房；LE：葉片。
為了研究DEGFu-sp基因的功能，我們首先研究了其中的轉錄因子，共發(fā)現(xiàn)了44個轉錄因子，花藥里面16個，子房里面10個，葉片里面18個。對DEGFu-sp基因的蛋白互作網(wǎng)絡分析表明這些基因相互之間有顯著的聯(lián)系，多個代謝通路富集程度較高。
GO富集分析表明花藥中的DEGFu-sp基因有19個生物學過程類別顯著富集，包括光合作用、代謝途徑、合成調控和轉錄調控。6個通路類別顯著富集，包括光合作用和代謝通路。13個基因在F1中的表達量顯著高于T452。在807個花藥特異的DEGFu-sp中，15個基因與46個其它重要基因共表達。
接下來用同樣的方法對子房和葉片中的DEGFu-sp基因進行了GO富集分析。在葉片當中有5個基因在F1中表達量顯著高于T452。H3水稻葉片在開花過程中顏色逐漸變化，而T452葉片在開花過程中顏色保持不變。因此，我們比較了葉片中F1比T452上調的基因，以及H3比T452上調的基因，兩者有74.01%的重合。有趣的是，在葉片中發(fā)現(xiàn)了兩個主要的功能基因類別，分別是程序性細胞死亡和防御反應。
4. 花藥特異性差異表達基因與減數(shù)分裂有關
因為T452育性較低，而F1代育性較高，為了研究育性的差異，我們重點研究了F1花藥中與T452相比上調的基因。首先，有643個基因在F1花藥中與T452相比特異上調，這其中排除了H3與T452相比上調的基因。對這643個基因進行GO分析表明，有6個功能基因類別富集，這些基因與防御反應、光合作用、細胞凋亡和程序性細胞死亡有關。這其中有41個基因在育性較低的同源四倍體中表達量低于二倍體。在這41個基因中，4個基因，LOC_Os04g33830，LOC_Os12g08770，LOC_Os06g21590，LOC_Os07g25430，與光合作用有關。
接下來，將這643個特異上調的基因與野生型水稻花藥減數(shù)分裂相關基因的表達量相互比較，發(fā)現(xiàn)有9個基因都在減數(shù)分裂前期到四分體期表達。
隨后，我們比較了花藥特異性差異表達基因DEGFu-sp和野生型水稻減數(shù)分裂相關基因表達數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)有42個減數(shù)分裂特異性基因和8個減數(shù)分裂相關基因（圖3）。在8個減數(shù)分裂相關的基因中，有兩個基因和DNA修復和染色體結構有關。
因為轉錄組也會被表觀遺傳調控，我們也進了小RNA測序。在花藥中發(fā)現(xiàn)了288個差異表達的miRNA（DER），其中有13個為新發(fā)現(xiàn)的。在這288個DER中，有38個只在F1與親本相比中特有，這38個基因被稱為DERFu。這38個DERFu有397個靶標基因。GO分析表明這397個靶標基因有7個功能基因類別富集，這些基因與細胞凋亡、防御反應、程序性細胞死亡、細胞自噬、DNA完整性和脅迫反應有關。而且，大部分靶標基因同于F1或者H3中上調的基因。然后我們比較了這38個DERFu與之前發(fā)現(xiàn)的差異表達miRNA數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其中一個miRNA，osa-miR5072_L-2_1ss3AG，在
Taichung65-2x和 Taichung65-4x水稻中的四倍體中下調。這個miRNA靶標基因為 LOC_Os02g24960，是一個逆轉錄轉座子基因。
圖3：與育性和雜種優(yōu)勢相關的基因在染色體上分布。紅色為葉片中的基因，藍色為花藥中的基因，黑色為子房中的基因。
表3：花藥中的差異表達miRNA（DER）列表
5.雜交F1代非累加基因表達
F1代表達的基因可以分成兩個類別，一類是累加基因，一類是非累加基因。累加基因的表達量來自兩個親本的等位基因之和，非累加基因的表達量由兩個親本等位基因的平均值決定。在三個組織中共發(fā)現(xiàn)了1224個非累加基因（NDEG），在花藥、子房和葉片中分別為314個，578個，332個。其中895個上調，329個下調。通過對花藥NDEG和水稻花藥減數(shù)分裂特異性基因表達數(shù)據(jù)的比較，發(fā)現(xiàn)了53個共有的基因。其中有7個基因在四倍體中表達量低于二倍體水稻。
表4：非累加表達基因（NDEG）和DEGFu及不同組織的DEGFu-sp數(shù)量統(tǒng)計。星號表示NDEG在F1表達的總基因中的比例。
6.DNA序列差異與雜交F1代的差異表達基因之間的關系
DNA重測序表明T452和H3有很多序列差異，兩者共有2351039個SNP，其中1192412個SNP在T452中特異存在，374460個SNP在H3中特異存在。兩者共有499448個Indel，其中248194個Indel在T452中特異存在，84196個Indel在H3中特異存在。將T452和H3相比，SNP和Indel多態(tài)性分別為66.77%和69.97%。在這些多態(tài)性位點中，約65%的SNP和72%的Indel在基因區(qū)。47.67%的SNP和53.37%的Indel位于差異表達基因的調控區(qū)域。另外，有58908個SNP和5561個Indel位于基因編碼區(qū)。
因為T452和H3存在大量的DNA序列差異，我們分析了DEGFu-sp中基因的DNA序列差異，結果表明花藥、子房和葉片中分別有330個、291個、459個基因存在DNA序列差異（SNP或Indel）?；ㄋ幭嚓P的330個基因可以分為15個不同的生物學過程類別，主要和光合作用、細胞代謝、轉錄和生物合成有關。子房相關的基因有1個生物學過程富集，即代謝通路。同樣的，葉片相關的基因有8個生物學過程富集，包括氮代謝、細胞運輸?shù)取＿@些富集的生物學過程基本上與DEGFu-sp富集的生物學過程一致。
另外，非累加差異表達基因中也有SNP和Indel，花藥、子房和葉片中分別有67個、133個、87個基因存在DNA序列差異，并對這些基因進行了富集分析。其中25個基因為轉錄因子。
結論
本研究培育了一個新型四倍體水稻H3，H3與同源四倍體T452雜交產(chǎn)生的F1代具有育性高、產(chǎn)量高等優(yōu)良的雜種優(yōu)勢性狀。通過比較H3，T452，以及雜交F1代的三個不同組織（花藥、子房、葉片）的轉錄組差異，尤其是重點分析了花藥的轉錄組差異，找到了多個與減數(shù)分裂有關的差異表達基因，這些基因可能與雜種優(yōu)勢有關。對花藥的小RNA測序也找到了一些F1中差異表達的miRNA，這些miRNA的靶基因也與轉錄組測序中上調的基因有大部分重合，說明miRNA可能參與調控了雜交F1代的性狀差異。對兩個親本DNA序列的差異進行全基因組重測序分析，并與轉錄組數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，找到了DNA層面上兩者育性差異的可能原因。
創(chuàng)新點
培育出高結實率的新型四倍體水稻，可以用于四倍體水稻育種；
轉錄組測序比較了新型四倍體水稻，同源四倍體水稻及雜交F1代不同組織的轉錄組差異，找到了影響四倍體水稻育性和雜種優(yōu)勢的相關基因；
小RNA測序和全基因組重測序結果與轉錄組數(shù)據(jù)相結合，深入解析性狀差異原因。
點評
這篇文章選取的實驗材料很好，性狀優(yōu)良，而且研究得很深入，比較了三種水稻三個不同組織的轉錄組，還進行了小RNA測序和全基因組重測序。通過深入分析，找到了一些影響水稻育性和雜種優(yōu)勢的相關基因，為后續(xù)的育種工作打下了基礎。
對多種測序手段結合分析感興趣的小伙伴快來試試吧！
參考文獻
Guo H, Mendrikahy J N, Lei X, et al. Transcriptome analysis of neo-tetraploid rice reveals specific differential gene expressions associated with fertility and heterosis[J]. Scientific reports, 2017, 7:40139.
]]>有沒有什么辦法，降低洋蔥辛辣的刺激性，提高洋蔥的甘甜的口感呢？
2016年9月，百邁客與北京農(nóng)林科學院蔬菜所的一項研究為解決這個問題提供了理論基礎。前人已有的研究表明，淀粉或蔗糖代謝在球莖的形成和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。為了分析洋蔥在球莖膨大過程中蔗糖的代謝和甜味的發(fā)展情況，我們利用RNA-seq對三個不同發(fā)育階段的洋蔥球莖進行轉錄組測序。
英文名稱：Transcriptome Analysis of Sucrose Metabolism during Bulb Swelling and Development in Onion (Allium cepa L.)
雜志：frontiers in plant science
影響因子：4.495
實驗材料
洋蔥球莖，每組樣本3個生物學重復。
DAS：day after swelling。
實驗思路
文章結果
經(jīng)過測序分析，我們最終鑒定了參與洋蔥球莖形成和發(fā)育的差異表達基因，篩選出與蔗糖、葡萄糖和果糖代謝相關的關鍵基因。
1.質量評估和數(shù)據(jù)過濾后共獲得72.53M clean reads。Q30在85%以上。說明測序數(shù)據(jù)的準確性和數(shù)據(jù)量滿足后續(xù)分析。用trinity將reads組裝到79376條Unigenes，平均長度為678bp。ContigN50為1093bp。
2.用BLASTX將組裝得到的序列與Nr，Swiss-Prot，GO，COG和KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，共有8288個Unigenes注釋到了25個COG類別中的11713個功能。有585個Unigenes注釋到“碳水化合物的運輸和代謝”。
3.為了鑒定在洋蔥球莖膨脹過程中活躍的通路，將得到的unigenes與KEGG數(shù)據(jù)庫中標準參考通路進行比對。15 DAS vs. 30 DAS注釋到了95個pathway，15 DAS vs. 40 DAS 注釋到了79個pathway，30 DAS vs. 40 DAS注釋到了86個pathway。共有6113個unigenes注釋到了120條KEGG通路中。“淀粉和蔗糖代謝”構成了各樣本文庫中的初級代謝途徑，并有可能在球莖膨大和發(fā)育過程中活性更高。
4.設置P < 0.01和|log2 (fold change)|≥1，篩選出在球莖發(fā)育過程中的差異表達基因。在3個不同發(fā)育階段共獲得5416個差異表達基因。為深入了解洋蔥發(fā)育過程中蔗糖代謝，結合文獻中的已有的報道并根據(jù)洋蔥RNA測序數(shù)據(jù)注釋中的關鍵詞搜索共列篩選出147個差異調控淀粉和蔗糖代謝的關鍵基因。根據(jù)洋蔥球莖發(fā)育過程中蔗糖、葡萄糖、果糖水平的變化，挑選出6個差異表達基因可能在洋蔥球莖發(fā)育早期發(fā)揮重要作用，分別為CWIN，SUT，SuSy (SuSy1，SuSy2)和INV (INV1，INV2)。
5.使用qRT-PCR驗證參與蔗糖代謝的差異表達基因。這6個差異表達基因的表達水平與RNA-seq結果是一致的。
結論
本研究結果表明，程序化的基因表達以及不同發(fā)育階段中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量變化對球莖膨大十分重要。這些發(fā)現(xiàn)對于我們理解洋蔥球莖發(fā)育的分子機制具有重要作用。相信在不遠的將來，這些理論基礎就會運用到實際當中，提高洋蔥的糖分，降低氣味刺激性，到那時，媽媽再也不用擔心切洋蔥時會辣眼睛了。
參考文獻
Zhang C, Zhang H, Zhan Z, et al. Transcriptome Analysis of Sucrose Metabolism during Bulb Swelling and Development in Onion (Allium cepa L.)[J]. Frontiers in Plant Science, 2016, 7.
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