1、提取方法

1)樣本研磨

2)將裝有樣品的離心管加入1 ml 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取液和2%的巰基乙醇（如 果是動物組織的話加50ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K），在渦旋振蕩儀上震蕩混勻，使樣品完全懸浮，65 ℃烘箱溫浴40 -60min，不能超過1h

3)溫浴期間搖勻2-3次，保證裂解充分。取出后，冷卻至室溫

4)12000 rpm離心5 min，取上清液900ul至新的2.0 ml 無菌離心管中（。加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min

5)吸取上清液700 ul至新的2.0 ml 無菌離心管，加入等體積三氯甲烷-異戊醇 （24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min

6)吸取上清液450 ul至新的1.5 ml無菌離心管中，加入上清液體積的2/3體積（300ul）的異丙醇和1/10體積（45ul）的3M乙酸鈉，充分混勻，-20 ℃放置1 h

7)12000rpm離心10min（如果從-20℃取出后絮狀沉淀較多，可12000rpm離心20s），棄上清，瞬時離心，用200ul槍頭吸棄多余液體

8)向沉淀中加1ml 75%的乙醇溶液，輕彈至沉淀懸浮，12000rpm離心5min，棄上清

9)瞬時離心，用黃槍頭吸棄多余液體，離心管開蓋室溫晾干3-5min至DNA沉淀呈半透明狀

10)加入≥20 ul含10 ng/ul RnaseA的超純水，根據(jù)沉淀大小決定融水體積，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴鍋消化1 h后保存在-20 ℃冰箱備用

注：常規(guī)植物組織提取正常使用CTAB提取，疑難植物（薔薇科等多糖類植物）組織裂解前使用干擾（清洗掉部分多糖等雜質(zhì)）先清洗，清洗完之后在加裂解液；動物組織在裂解時加入2%的蛋白酶K；宏基因組項目提取在裂解時加入5%-10%的溶菌酶

2、檢測方法

2.1檢測方法

使用 使用 Qubit（廠家YEASEN, 型號CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ）檢測核酸濃度，使用1%的瓊脂糖電泳檢測完整性

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

濃度≥5ng/ul

總量大于等于8 0 ng

主帶清晰、主帶不清晰，主要彌散在2K以上

核酸狀態(tài)正常

3、建庫方法

3.1建庫流程圖

3.2樣本稀釋

1)核對任務(wù)單中項目樣品基本信息，根據(jù)信息單一一對應(yīng)排好樣本

2)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)用量，計算“稀釋后濃度(ng/μL)”和“吸取體積(μL)”

3)取已滅菌的國產(chǎn)96孔PCR板，在板子上標(biāo)注相應(yīng)的項目編號、板號、日期及稀釋字樣，并開始稀釋

4)稀釋后，震蕩輕混（勿劇烈震蕩）并瞬時離心，對稀釋后的樣品取2 μL做Nanodrop 檢測

5)如果濃度與理論濃度偏差較大先檢查樣品是否用錯，在確認(rèn)樣品使用無誤的情況下，濃度高的加水稀釋，濃度低的加DNA或者重新稀釋

3.3步驟A

根據(jù)任務(wù)單的酶切方案選擇下面所列單酶切或雙酶切方案，取適當(dāng)起始量樣本，進(jìn)行37℃酶切反應(yīng)，在水浴鍋中反應(yīng)時長不超過15h

3.4步驟B

在上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入試劑，在PCR儀器中進(jìn)行3′端加A處理

3.5步驟C

向上述產(chǎn)物中加入一定體積的連接試劑及index，充分混勻，進(jìn)行Dual-index測序接頭反應(yīng)

3.6PCR 擴(kuò)增及電泳檢測

1)加入 PCR 反應(yīng)所需的各種試劑，混勻，離心

2)根據(jù) PCR 反應(yīng)條件，放入 PCR 儀中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增

3)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測

3.7PCR 產(chǎn)物的純化及電泳檢測

1)將全部PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化

A.將MagicPure Size Selection DNA Beads（全式金）磁珠提前 30min 室溫平衡備用

B.將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入 1.5mL 離心管中，加入（0.8 X）體積已混勻的磁珠，吹吸混勻

C.旋轉(zhuǎn)混勻儀上，室溫混勻，瞬時離心，而后置于磁力架上，靜置，移棄上清液

D.離心管置于磁力架上，向離心管中加入新鮮配制的 80%乙醇，磁力架上靜置 30s，移棄上清液

E.重復(fù)步驟（4）一次，第二次清洗后，瞬時離心，用 10μL 槍頭將上清液去除干凈

F.離心管置于磁力架上，打開管蓋，室溫干燥至磁珠表面無光澤，有細(xì)微裂紋

G.取下離心管，加入無菌水，吹吸混勻，室溫靜置，而后磁力架上靜置，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的 0.2mL PCR 管中

2)對PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測

3.8定量及混樣

1)將PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行Nanodrop 定量

2)根據(jù)上機(jī)數(shù)據(jù)量及定量結(jié)果，電泳結(jié)果，回收膠電泳上樣量，進(jìn)行混樣量計算

3)向1.5ml離心管中按照計算好的混樣量，加入PCR純化產(chǎn)物，并混合均勻

3.9電泳切膠

1)配制2%電泳回收膠

2)使用TAE跑電泳，根據(jù)下單規(guī)定的切膠范圍進(jìn)行切膠

3)對切膠片段進(jìn)行過柱純化回收

3.10上機(jī)文庫構(gòu)建PCR擴(kuò)增

1)在上述膠回收產(chǎn)物中加入 PCR 反應(yīng)所需的各種試劑，混勻，離心

2)根據(jù) PCR 反應(yīng)條件，放入 PCR 儀中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增及純化

3.11上機(jī)文庫準(zhǔn)備

將PCR純化產(chǎn)物出庫，進(jìn)行后續(xù)文庫質(zhì)檢及上機(jī)測序

3.12文庫質(zhì)檢

1)質(zhì)檢方法：文庫通過 Qsep-400進(jìn)行片段質(zhì)檢， 使用 Qubit 3 .0進(jìn)行文庫濃度的定量

2)質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)：濃度≥1ng/ul ，峰圖在要求切膠范圍之內(nèi)，片段單一無雜峰

3.13建庫試劑耗材

1)文庫構(gòu)建試劑：NEB（New England Biolabs）（使用的是單個散裝試劑，不是成套試劑盒，具體試劑保密）

2)產(chǎn)物純化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 貨號N411-03

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標(biāo)準(zhǔn)DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.14建庫設(shè)備

4、測序方法

測序設(shè)備：NovaSeq X plus

測序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，提供了高質(zhì)量的棉纖維用于工業(yè)生產(chǎn)和人類使用。不斷增長的工業(yè)需求給棉花增產(chǎn)提出了更高的要求。單鈴重是重要的產(chǎn)量構(gòu)成因子之一，如何在不降低其他纖維品質(zhì)的前提下提高產(chǎn)量是育種家孜孜以求的目標(biāo)。通過MAS輔助育種能夠直接對基因型進(jìn)行選擇?；谶z傳圖譜的QTL定位研究可以定位到相應(yīng)的功能基因或者與功能基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，因此能極大地促進(jìn)MAS研究。常規(guī)的SSR標(biāo)記很難構(gòu)建飽和的遺傳圖譜，而利用SNP標(biāo)記則可以解決這個問題。利用高通量測序技術(shù)能夠?qū)θ蚪M開發(fā)SNP標(biāo)記，使高密度遺傳圖譜構(gòu)建成為可能。
本研究利用SLAF-seq技術(shù)對包含196個子代的陸地棉RIL群體構(gòu)建高密度遺傳圖譜，并結(jié)合多年多點單鈴重的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位。同時針對QTL定位區(qū)域進(jìn)行候選基因的挖掘。

材料和方法

本文親本是0-153和sGK9708，0-153纖維品質(zhì)較好，而sGK9708產(chǎn)量潛力高且適應(yīng)性廣。雙親單鈴重性狀差異極顯著。F6:8重組自交系196個。方法：利用SLAF-seq技術(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜并進(jìn)行QTL定位。QTL定位軟件：Windows QTL Cartgrapher 2.5。

結(jié)果分析

共獲得443.56M reads共計87.89GB數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)Q20為82.24%，GC含量為34.47%。親本共開發(fā)SLAF標(biāo)簽5.3萬個，深度分別為78.66X和102.13X。子代平均開發(fā)5萬個SLAF標(biāo)簽，平均深度為14.5X?；赟LAF標(biāo)簽共開發(fā)出160876個SNP，其中親本中多態(tài)性有23519個，多態(tài)率為14.62%。適合棉花作圖的SNP標(biāo)記（aaxbb型）18318個，去除低質(zhì)量、低深度和極顯著偏分離的標(biāo)記后后剩余5521個SNP用于遺傳圖譜構(gòu)建。構(gòu)建了棉花A基因組和D基因組連鎖群26個，共3259.37cM的遺傳圖譜，平均圖距0.78cM。其中A基因組包含標(biāo)記3550個，遺傳距離1838.37個，D基因組包含標(biāo)記個1971個，遺傳距離1971cM。

（1）遺傳圖與棉花物理圖譜共線性分析發(fā)現(xiàn)圖譜覆蓋度良好，絕大多數(shù)的SNP與物理圖譜的共線性良好，相對于A基因組而言，D基因組的共線性更好。

（2）重組熱點分析發(fā)現(xiàn)26條連鎖群中，21條含有重組熱點區(qū)域，A套中9條LG含有重組熱點，D套中12條LG含有重組熱點。所有LG中，13號含有重組熱點最多，有196個。
結(jié)合多年多點的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位，共檢測到11個不同環(huán)境下146個單鈴重的QTL位點，其中16個能在至少3個環(huán)境中重復(fù)檢測到。這16個QTLs中qBW-chr13-7能在7種環(huán)境下檢測到，包含26個SNP標(biāo)記，解釋表型變異率在6.13%-14.7%之間。結(jié)合參考基因組共鑒定出344個候選基因，其中340個基因含有注釋信息，并利用GO，KEGG和KOG數(shù)據(jù)分別進(jìn)行基因富集分析。為更進(jìn)一步精細(xì)定位和MAS育種奠定基礎(chǔ)。

基本測序結(jié)果分析：

在自然狀態(tài)下很難保證所有F1群體均是目標(biāo)親本的子代，所以作者進(jìn)行了親自鑒定的工作，最終剩下157個正牌的F1子代；
共獲得了139,113,148個reads，其中Q值大于30以上的高質(zhì)量數(shù)據(jù)占88.64%，GC含量為37.45%。父母本reads數(shù)分別為9,025,115和8,571,660，F(xiàn)1子代平均為773,990。與之對應(yīng)的高質(zhì)量SLAF-tag數(shù)為239,704個，其中父母本中開發(fā)的SLAF-tag數(shù)分別為201,805和206,806個，深度為19.25X和20.70X；子代中平均SLAF-tag為123,038個，平均深度為3.11X；
聚類分析后共獲得多態(tài)性的SLAF-tag132,542個，其中可成功進(jìn)行二等位編碼的SLAF-tag108,004個，選擇適合F1群體作圖的多態(tài)性標(biāo)記后，利用測序深度和完整度過濾，最終剩余4,508個多態(tài)性SLAF標(biāo)記用于遺傳圖譜的構(gòu)建；

遺傳圖譜構(gòu)建：

結(jié)合506個SSR標(biāo)記和4,508個SLAF標(biāo)記，進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建，成功構(gòu)建了珍珠蚌19條連鎖群，共含有標(biāo)記4,920個，中性圖總圖距為2,713cM，平均圖距為1.81cM。雄性圖包括3,233個標(biāo)記，總圖距2,561cM，雌性圖包含標(biāo)記3,123個，總圖距2,810cM；

圖1 珍珠蚌高密度遺傳圖譜

遺傳圖譜比較統(tǒng)計分析：

作者之前利用SSR標(biāo)記做的遺傳圖譜和利用SLAF-seq構(gòu)建的遺傳圖譜進(jìn)行了比較。兩張遺傳圖譜均構(gòu)建了珍珠蚌19條連鎖群，但是標(biāo)記數(shù)，圖距，分辨率均不同。SSR標(biāo)記包含了506個標(biāo)記，總圖距1,922.3cM，平均圖距3,99cM，大的Gap數(shù)較多，而基于SLAF-seq的圖譜在以上指標(biāo)上均顯著優(yōu)于SSR標(biāo)記圖譜。

QTL定位分析：

共定位到了26個和珍珠品質(zhì)相關(guān)的QTL，分別位于第1,4,8，14，15和17號連鎖群上，PVE范圍為8.45%-22.8%。在1號連鎖群上定位到3個殼寬QTLs，在第1和第15號連鎖群上分分別定位到1個控制殼重的QTL。第8號染色體上定位到體重相關(guān)的7個QTL，另外，作者也定位到了大量其他性狀的QTL。同時對第17號染色體上的4個和貝殼珍珠層顏色相關(guān)的QTL進(jìn)行簡單的統(tǒng)計驗證。

文章亮點總結(jié)：

1.材料：珍珠蚌需要生長到一定年限才能有珍珠產(chǎn)生，本文材料非常難得，是能獲得較好結(jié)果的基礎(chǔ)；2.有SSR遺傳圖譜的構(gòu)建，并與SLAF標(biāo)記進(jìn)行了整合，圖譜密度高；
3.利用遺傳圖譜定位到了大量和珍珠質(zhì)量相關(guān)的QTL，相關(guān)標(biāo)記可以進(jìn)一步開發(fā)用于分子標(biāo)記輔助育種，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值；
4.部分QTL區(qū)域的標(biāo)記進(jìn)行簡單的統(tǒng)計學(xué)驗證，使QTL定位結(jié)果的可靠性增加。
本期文獻(xiàn)解讀就到這里，提前透露下，圖譜君最近正在運作另外一篇水產(chǎn)物種的圖譜構(gòu)建，QTL并且利用一種高（漲）逼（姿）格（勢）的方法進(jìn)行QTL驗證的文章，敬請期待~~~

參考文獻(xiàn)：
Bai Z Y, Han X K, Liu X J, et al. Construction of a high-density genetic map and QTL mapping for pearl quality-related traits in Hyriopsis cumingii[J]. Scientific Reports, 2016, 6.