2024年2月，四川大學華西醫(yī)院在國際學術期刊ANNALS?of Clinical and Translational Neurology發(fā)表一項重要研究成果，題為：Decoding the biology and clinical implication of neutrophils in intracranial aneurysm。使用單細胞 RNA 測序?(scRNA-seq)、RNA-seq 和小鼠模型來剖析在破裂和未破裂的顱內動脈瘤中性粒細胞的功能和臨床意義。

文章標題：Decoding the biology and clinical implication of neutrophils in intracranial aneurysm

期刊名稱：ANNALS?of Clinical and Translational Neurology

合作單位：四川大學華西醫(yī)院

研究對象：顱內動脈瘤

研究方法：scRNA-seq、RNA-seq?數據挖掘、小鼠模型等

百邁客為該研究提供了單細胞轉錄組測序服務。

研究背景

顱內動脈瘤（IA）是一種常見的腦血管疾病，最終可導致毀滅性的出血性中風。據估計，IA 的患病率為 3%-5%，由于人口老齡化和血管造影成像檢查的日益普及，這一數字正在增加。大多數 IA 在整個生命周期中保持穩(wěn)定，而大約 1% 會進展和破裂，導致致命的動脈瘤性蛛網膜下腔出血，此種情況下超過一半的患者死亡和殘疾。不穩(wěn)定的 IA 的特征是動脈瘤體積較大、形狀不規(guī)則，或者患者存在衰老、高血壓或吸煙等各類遺傳和環(huán)境高危因素。總體而言，目前對不穩(wěn)定 IA 發(fā)生和進展機制的理解還不夠充分，這強調了闡明 IA 壁的病理生理學改變和破裂相關的機制的重要性。

實驗材料

對多個動脈瘤臨床樣本和小鼠動脈瘤模型樣本進行了單細胞測序。深度分析動脈瘤數據集GSE13353和GSE122897。

1、scRNA-seq

在搭橋手術或夾閉術之前，從經血管造影診斷為未破裂 IA 和動脈瘤 SAH 的患者中收集沒有血栓的新鮮 IA 圓頂進行單細胞測序。任何懷疑患有導致血管動脈瘤病變的遺傳性疾病的患者均被排除。并取小鼠 IA 模型的腦動脈瘤組織進行單細胞測序。

2、Bulk RNA-seq

深度分析動脈瘤數據集GSE13353和GSE122897。

研究結果

1.IA 組織中中性粒細胞的鑒定

根據之前明確的基因標記，包括FCGR3B、CSF3R、CXCR2和G0S2，總共9025個中性粒細胞被人工分配（圖1A–C）。該研究進一步使用 Azimuth 自動注釋這些細胞，得到 8435 個中性粒細胞。IA1 是一種破裂的 IA 組織，與其他樣本相比，其中性粒細胞數量最多（圖1D）。總體而言，IA 破裂時中性粒細胞較多，這可能與 IA 破裂及隨后的局部血栓形成有關。值得注意的是，ssGSEA 分析顯示，中性粒細胞浸潤發(fā)生在 IA 破裂階段。根據中性粒細胞獨特表達的標記基因，當 IA 破裂時，IA 形成和中性粒細胞數量增加（圖1E）。總之，這些結果強烈表明中性粒細胞參與 IA 進展。

先前的研究表明中性粒細胞的功能和進化具有異質性，而IA穹隆中的中性粒細胞亞群仍然知之甚少。該研究使用“FindClusters”功能以更高分辨率（分辨率?=?0.9）重新聚類中性粒細胞，以識別不同的中性粒細胞群落。結果，鑒定出八個中性粒細胞亞群（C0-C7）（圖2A-B）。富集分析揭示了 C1 和 C6 中細胞凋亡途徑的正調節(jié)富集。具體而言，中性粒細胞胞外池?(NET) 的形成促進 IA 破裂，在 C1 中富集。對應激反應、脫顆粒和 NET 形成在 C8 中豐富，伴侶介導的蛋白質折疊和自噬在 C3 中豐富，表明這些細胞也受到應激。TNF、NF-κB 和中性粒細胞脫粒等通路在 C0、C4、C5 和 C7 中富集，表明這些細胞執(zhí)行中性粒細胞的促炎功能。此外，還進行了 RNA 速度分析來描繪中性粒細胞亞簇的潛在軌跡。結果，這些細胞形成了包含兩個分支的軌跡。C5 和 C6 亞簇可能是軌跡的末端，CR1、MEF2C?和?SYK?參與細胞凋亡（圖 2C）。

最近的研究根據中性粒細胞從骨髓到外周血的遷移決定了中性粒細胞的轉錄組特征，即“中性粒細胞”。該研究基于scRNA-Seq數據集研究了小鼠 IA 模型中性粒細胞浸潤到IA組織時是否存在這種轉錄組特征。結果顯示假手術中存在少量中性粒細胞富集，并形成小鼠模型高表達的基因標記，包括Ifitm6、Ltf、Camp?和?Chil3。這些細胞表達較低成熟或老化的基因標記，如Malat1、Msrb1、Il1b和Ccl6（圖?3A），表明它們是從外周血新滲入的。執(zhí)行單片算法來識別細胞進化軌跡，并將這些新滲透的細胞指定為起點（圖3B）。根據莫蘭斯指數 (morans I) 以及未破裂（假手術）和破裂小鼠模型中的基因表達，該研究計算了 IA 組織中新浸潤和老化中性粒細胞的基因特征（圖3C）。與之前的研究一致，新浸潤的中性粒細胞高表達Cebpe，在粒細胞生成和炎癥因子產生中發(fā)揮作用，而相對老化的中性粒細胞表達S100a 家族基因和伴侶，如?Hspa1b、Has1a1?和?Hsp90aa1，表明壓力或衰老狀態(tài)。富集分析揭示了這些細胞的不同功能，新浸潤的中性粒細胞中富集了多種代謝途徑，而老化的中性粒細胞則激活了炎癥和凋亡相關途徑（圖3D）。總之，這些結果表明 IA 組織中存在中性粒細胞，并強調了它們的功能異質性。

2.募集中性粒細胞的細胞和細胞因子

在之前的研究中忽略了中性粒細胞向 IA 組織的局部募集，為了填補這一空白，使用 cellphoneDB 算法進行了細胞間通信分析。該研究首先表征了未破裂 IA 組織中參與中性粒細胞募集的細胞和細胞因子。結果顯示血管細胞（內皮細胞、SMC 和周細胞）和免疫細胞（單核/巨噬/DC、中性粒細胞、T/B 淋巴細胞和肥大細胞）廣泛產生中性粒細胞趨化因子（圖4A）。高頻趨化因子包括 CXCL2/3/1，它與 CXCR2/1 和 CCR1 等中性粒細胞受體結合（圖 4B）。在未破裂的 IA 中，主要參與中性粒細胞募集的細胞是單核細胞/巨噬細胞，包括 Mono.1/2 和 Macro.1/2。在破裂的 IA 中招募中性粒細胞的趨化因子與未破裂的 IA 中的趨化因子表現出相似的模式組成，但對 CXCL3 和 CCL5 的依賴性更高（圖 4C,D）。接收這些信號的中性粒細胞受體是保守的（圖4D）。

3.中性粒細胞與IA形成和破裂之間的關聯

為了研究中性粒細胞浸潤的病理意義，該研究首先展示了破裂和未破裂樣本中每種類型的中性粒細胞的比例。破裂樣本中除 C6 之外的中性粒細胞亞群有所增加（圖5A）。該研究進一步整理了這些中性粒細胞的基因特征，發(fā)現C0和C5在破裂的IA組織中顯著富集（圖5B，D）。此外，與正常血管組織相比，未破裂 IA 中的 C0 和 C5 也顯著富集，與 C4 和 C8 相同（圖5C），表明中性粒細胞參與 IA 形成和破裂。接下來，進行 ROC 分析以評估中性粒細胞亞群與 IA 形成和破裂之間的關聯。結果顯示C0和C6的ssGSEA評分在預測IA破裂方面產生了令人滿意的AUC值（兩個數據集中的AUC?>?0.7）（圖5E），表明這些細胞可能參與IA破裂。反過來，C4 和 C5 在預測 IA 形成方面表現良好。在此基礎上，C0 和 C5 的局部滲透分別是 IA 破裂和形成的有力預測因子。

4.IA穹隆中性粒細胞鐵死亡

中性粒細胞介導的炎癥對 IA 壁具有破壞性。最近，新出現的證據表明，中性粒細胞在某些情況下對鐵死亡敏感，這將進一步促進局部炎癥級聯反應并促進 IA 進展。在此，該研究描述了 IA 中中性粒細胞與鐵死亡之間的潛在關聯。該研究根據兩個批量轉錄組數據集計算了 DEG，并注釋了鐵死亡驅動基因和抑制基因（圖 6A,B）。結果顯示在破裂的 IA 組織中，幾個鐵死亡驅動基因和抑制基因有顯著差異，表明鐵死亡途徑失調。破裂的 IA 組織的鐵死亡驅動基因 ssGSEA 評分高于未破裂組織，而抑制基因的 ssGSEA 評分相當（圖6C），表明鐵死亡與 IA 破裂之間存在關聯。值得注意的是，未破裂的 IA 組織的鐵死亡驅動基因得分高于對照樣本，表明鐵死亡也可能參與 IA 的形成。多個基因與中性粒細胞鐵死亡有關，例如谷胱甘肽過氧化物酶 4(GPX4) 和微粒體谷胱甘肽 S 轉移酶 1 (MGST1) 充當鐵死亡抑制劑；花生四烯酸脂氧合酶 5(ALOX5)、花生四烯酸脂氧合酶 5 激活蛋白(ALOX5AP)、花生四烯酸脂氧合酶 12(ALOX12)、花生四烯酸脂氧合酶 15(ALOX15) 和前列腺素 2(PTGS2) 充當鐵死亡驅動程序。在單細胞分辨率下，中性粒細胞高表達PTGS2和ALOX5AP（圖6D），它們與鐵死亡顯著相關，表明這些細胞參與前列腺素和白三烯的產生，并且對鐵死亡敏感。盡管數量較少，但肥大細胞高度表達 ALOX5 和 ALOX12。鑒于白三烯可以通過多細胞協同方式產生，局部白三烯可能是由中性粒細胞和肥大細胞以協同方式產生的?？傊@些結果表明 IA 組織中中性粒細胞的鐵死亡可能是由 ALOX5AP 和 PTGS2 驅動的，并且可以由肥大細胞促進。

5.中性粒細胞NETosis

NET 的產生是中性粒細胞導致 IA 破裂的另一種方式，且取決于稱為 NETosis 的過程。因此，抑制 NETosis 是 IA 有前景的治療靶點。然而，由于這些細胞的多功能性，發(fā)生 NETosis 的中性粒細胞亞群尚不清楚。作者的結果表明 NETs 形成信號通路在 C1 中富集（圖2B）。該研究從京都基因和基因組百科全書 (KEGG) 數據庫中收集了人類 NETosis 基因特征，發(fā)現 NETosis 的 ssGSEA 評分在 C1 中升高（圖7A）。PADI4?的表達對于組蛋白瓜氨酸化至關重要，在 C1 中上調，并表現出正相關的未剪接/剪接 mRNA 比率（圖 7B），表明PADI4在驅動C1 NETosis中發(fā)揮作用。此外，PADI4的表達與C1中NETosis的ssGSEA評分成正比（圖7C），證實C1易于發(fā)生NETosis。與其他中性粒細胞相比該中性粒細胞子集專門表達?MNDA?(Pct.1?=?91.8%, Pct.2?=?54.5%),?CREB5?(Pct.1?=?74.7%, Pct.2?= 33.7%) 和?LRKK2?(Pct.1?=?78.4%, Pct.2?=?36.2%) ?(圖7D)，因此可以作為抑制 NETs 介導的 IA 進展的目標。

研究總結

該研究使用?scRNA-seq?對腦動脈瘤臨床樣本和小鼠IA模型樣本進行了測序。作者發(fā)現未破裂和破裂的?IA?穹頂都含有大量中性粒細胞，以表達FCGR3B、G0S2、CSF3R?和?CXCR2等基因為特征。這些細胞在功能和分化方面表現出異質性。盡管具有相似的基因表達譜，但IA穹頂中的中性粒細胞表達了一系列特征基因并與從骨髓到外周血遷移觀察到的轉錄組學改變相似。此外，未破裂的?IA?中中性粒細胞的募集主要由單核細胞/巨噬細胞介導，一旦破裂，中性粒細胞和炎癥平滑肌細胞 （SMC） 的特定亞群都參與該過程。ROC分析表明，不同的中性粒細胞亞簇分別與IA的形成和破裂相關。通過回顧目前的研究，發(fā)現中性粒細胞通過特異配體、ALOX5AP?和?PTGS2?驅動的鐵死亡，以及?PADI4?介導的NETosis對?IA 壁完整性起著不利作用。