1、提取方法

1.1植物組織：CTAB法

1)液氮研磨樣品，分裝至離心管中

2)向離心管中加入 CTAB，水浴

3)離心后向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1），離心

4)向上清中加入異丙醇和乙酸鈉溶液，離心，棄上清

5)加入 75％乙醇，離心，棄上清

6)晾干，加入 TE 溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱

1.2動(dòng)物組織：SDS法

1)液氮研磨組織樣，分裝至離心管中

2)加入 SDS 溶液，水浴

3)加入 NaCl 溶液，靜置后離心

4)向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1）后離心

5)向上清中加入異丙醇后離心，棄上清

6)加入 75％乙醇，離心，棄上清

7)晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱

1.3動(dòng)物血液：Kurabo 試劑盒法

QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，廠家：Kurabo，貨號(hào)：40321300101

1.4粗體核酸純化

試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 20/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10223

試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 100/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10243

1.5微生物樣本

使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取

2、檢測(cè)方法

2.1檢測(cè)方法

1)濃度檢測(cè)

Nanodrop：賽默飛 Thermo ，型號(hào) NANODROP2000

Qubit：invitrogen ，型號(hào)QubitTM3Flurometer

2)完整性檢測(cè)（瓊脂糖凝膠電泳）

電泳儀：廠家：天能 Tanon ，型號(hào) EPS600

電泳槽：廠家：天根生化科技（北京）有限公司，型號(hào)：HE- 120

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

1)總量≥6μg（單次建庫(kù)）

2)濃度≥50ng/ul

3)體積≥10(ul)

4)OD260/280在1.7-2.2之間，OD260/230在1.7-2.5之間

5)AGE：size≥23K，降解條帶>5K，點(diǎn)樣孔無(wú)或有輕微污染，N/Q在0.9-2.0之間

6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

注：特殊物種實(shí)驗(yàn)人員會(huì)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷，具體以檢測(cè)報(bào)告中的判斷結(jié)果為準(zhǔn)

3、建庫(kù)方法

1) DNA 打斷

A.加入0.75-1.5 μg gDNA，補(bǔ)Elution Buffer 至100 μL，將gDNA樣品稀釋到終濃度為7.5 ng/μL -15 ng/μL。小心轉(zhuǎn)移到g-TUBE 管中，4600rpm離心2分鐘

B.重復(fù)離心，直至全部gDNA樣品通過(guò)g-TUBE孔洞

C.倒置g-TUBE管，離心2分鐘

D.收集打斷好的gDNA樣品于新的1.5 mL低吸附離心管中

2)PB純化

A.將gDNA樣品稀釋到100 μL，若體積超過(guò)100 μL，則不需要稀釋

B.向樣品中中加入 0.45*體積的AMPure PB磁珠（室溫平衡30分鐘）

C.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒

D.室溫放置30分鐘，瞬離1秒

E.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離，備用

F.使用1.5ml 新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次

G.瞬離1s，將酒精棄凈

H.向管中加入20 μL 1X Elution Buffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻

I.10-15分鐘溶解DNA，瞬離1秒

J.吸取20 μL上清液于新的1.5 mL低吸附離心管中

K.取1 μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測(cè)定

3)DNA修復(fù)

A.向純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑：

B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒

C.向每個(gè)樣品中加入14μL Reaction Mix 1

D.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1秒

E.孵育

4)接頭連接

A.向上述產(chǎn)物中分別加入以下試劑

B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒

C.向每個(gè)樣品中加入35μL Reaction Mix 2

D.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1秒

E.孵育

5)PB純化

A.向樣品中中加入1*體積的SMRT bell cleanup beads（室溫平衡30分鐘）

B.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒

C.室溫放置10分鐘，瞬離1秒

D.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離，備用

E.使用1.5ml新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次

F.瞬離1s，將酒精棄凈

G.向管中加入40μL1XElutionBuffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻

H.室溫5分鐘溶解DNA，瞬離1秒

I.吸取40μL上清液于新的1.5mL低吸附離心管中

J.取1μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測(cè)定

6)酶處理

A.向上述純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑

B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒

C.孵育

7)PB磁珠片段篩選

A.向上述產(chǎn)物中加入3.1*體積的2.85*稀釋的AMPurePB磁珠（室溫平衡30分鐘）

B.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒

C.室溫放置20分鐘，瞬離1秒

D.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管，備用

E.使用1.5ml新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次

F.瞬離1s，將酒精棄凈

G.向管中加入1X Elution Buffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻

H.室溫10-15分鐘溶解DNA，瞬離1秒

I.吸取上清液于新的1.5mL低吸附離心管中

J.取1μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測(cè)定。純化后DNA樣品可以在4℃保存2周，可以長(zhǎng)期保存于-20℃，但避免反復(fù)凍融

4、測(cè)序方法

1)最終文庫(kù)通過(guò)濃度（Qubit）及大?。ˋgilent 5400）的檢測(cè)，總量需要大于Smrtlink計(jì)算值。

2)使用REVIO SPRQ POLYMERASE KIT（Pacbio，USA） 對(duì)上機(jī)文庫(kù)進(jìn)行上機(jī)前的結(jié)合，使文庫(kù)結(jié)合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）

3)將最終的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SMRTbell cleanup beads（Pacbio，USA）純化后置于Revio（Pacbio，USA）測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序

5、實(shí)驗(yàn)用試劑

 

6、實(shí)驗(yàn)用設(shè)備