1、提取方法

1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號：DP441）

2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號：RN40））試劑盒

3)動物常規(guī)組織：TRIzol

4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號：217004）

5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號：2145A）試劑盒

6)EDTA抗凝血：TRIzol

2、檢測方法

2.1檢測方法

使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號 ：Nanodrop2000）對于提取的核酸進行濃度純度檢測，并使用 LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號：LabChip GX Touch HT）對完整性進行檢測

2.2判定標準

1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫

2)濃度≥20（ng/ul）

3)體積≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常

5)RIN 值≥4.0（非植物），RIN 值≥4.0（植物），同時若 GX 檢測 6.0-4.0 的需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬

6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

3、建庫方法

3.1mRNA純化及打斷

1) mRNA與磁珠第一次結(jié)合

A.將 mRNA Capture Beads 置于四維旋轉(zhuǎn)儀上充分混勻，平衡 30min 后使用

B.將 mRNA Capture Beads 加入到準備好的總 RNA 樣品中混勻，65℃孵育，使 RNA 變性

C.變性結(jié)束后，室溫放置 5min ，使 mRNA 結(jié)合到磁珠上

D.將樣品管置于磁力架上靜置，磁珠充分吸附到磁鐵一側(cè)后，移棄上清液

E.將樣品從磁力架上取出，用Wash Buffer 吹吸后置于磁力架上，磁珠充分吸附到磁鐵一側(cè)后，移棄上清液

F.將樣品從磁力架上取出，加入 Tris Buffer 吹吸混勻，80℃洗脫mRNA

2) mRNA 與磁珠第二次結(jié)合

A.向上步離心管中加入 Beads Binding Buffer ，吹吸混勻，室溫放置 5min ，使 mRNA 重新結(jié)合到磁珠上

B.將樣品置于磁力架上，使磁珠充分吸附到磁鐵一側(cè)，然后移棄上清液

C.將樣品從磁力架上取出，用 Wash Buffer 吹吸混勻，置于磁力架上 2min ，移棄上清液

D.將樣品從磁力架上取出，加入 Frag/Prime Buffer 并吹吸混勻

3) mRNA 的打斷

將上述 mRNA 產(chǎn)物中加入放入 PCR 儀中，根據(jù)樣品質(zhì)量等情況判定相應的打斷條件，打斷完成后立即放在冰上。

3.2合成 cDNA 第一條鏈

向上步反應的離心管中加入反轉(zhuǎn)錄第一條鏈所需的試劑，混勻離心后放入 PCR 儀中設定好程序進行cDNA 第一條鏈的合成

3.3合成 cDNA 第二條鏈（含末端修復及加A尾）

向合成的 cDNA 第一條鏈產(chǎn)物中依次加入二鏈合成反應的試劑，混勻離心后放入 PCR 儀中設定好程序進行二鏈的合成

3.4連接接頭

向上述反應產(chǎn)物中依次加入接頭和連接酶，金屬浴中孵育，進行接頭連接反應

注：Adaptor 中包含 Index 序列，使用時需嚴格按照上機調(diào)度安排的序列添加

3.5連接產(chǎn)物純化及片段選擇

1)向上述反應產(chǎn)物加入相應體積的（0.6X）已混勻的磁珠，混勻，室溫孵育而后置于磁力架上，待磁珠吸附到 磁力架一側(cè)后移棄上清液

2)離心管置于磁力架上，加新鮮配制的 80% ethanol ，靜置 30s ，移棄上清液

3)重復步驟 2 一次，第二次清洗后離心用 10ul 槍頭將上清液去除干凈

4)離心管置于磁力架上，打開管蓋，空氣干燥

5)取下離心管，加入 Nuclease-free Water，混勻，室溫孵育，而后置于磁力架上靜置，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的離 心管中

6)向上述離心管中加入（0.6X） 已混勻的磁珠，混勻，室溫孵育而后置于磁力架上

7)吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，并向該離心管中加入（0.1X）已混勻的磁珠，混勻后室溫孵育

8)孵育結(jié)束后置于磁力架上，待磁珠和上清液分開后棄掉上清液

9)離心管置于磁力架上，加入新鮮配制的 80% ethanol，磁力架上靜置 30s，移棄上清液；重復該步驟一次

10)離心管置于磁力架上，打開管蓋，空氣干燥

11)取下離心管，加入 Nuclease-free Water，吹吸混勻，室溫靜置；而后磁力架上靜置 ，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的 0.2ml 離心管中

3.6PCR 擴增

向上述離心管中加入 PCR 反應所需的各種試劑，混勻后離心，根據(jù) PCR 反應條件，放入 PCR 儀中進行 PCR 擴增

3.7PCR 產(chǎn)物純化

1)瞬時離心 PCR 反應管，加入相應體積的磁珠，充分混勻

2)室溫孵育，然后置于磁力架上靜置，小心移除上清液

3)向反應管中加入新鮮配制的 80% ethanol ，磁力架上靜置 30s ，移棄上清液，重復該步驟 1 次

4)打開管蓋，磁珠干燥后加入 Nuclease-free Water 洗脫 DNA ，吹吸混勻，室溫靜置，磁力架上靜置，小心 吸取上清至新的離心管中，并分裝 1.5 μL 于新的 1.5 mL 離心管中用于片段檢測，-20℃保存

3.8文庫質(zhì)檢

文庫通過 Qsep-400 方法進行質(zhì)檢，滿足如下指標即可上機檢測

3.9引物接頭序列

adpter3=”AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC”;

adpter5=”AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT”;

3.10建庫試劑耗材

1)文庫構建試劑盒：Hieff NGS Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina（翌 圣），貨號 13533ES96

2)產(chǎn)物純化磁珠：HieffNGS DNA selection Beads (Superior Ampure XPalternative)（翌圣），貨號 12601ES56

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標準DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.11建庫設備

4、測序方法

測序設備：NovaSeq X plus

測序試劑盒：NovaSeqTM X? Series25B Rgt Kit