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原核鏈特異性轉錄組

基因表達精準研究

原核鏈特異性轉錄組服務介紹

原核轉錄組指的是在特定時間、特定環(huán)境條件下，一個原核生物（如細菌、古菌）細胞內所有轉錄本（RNA）的集合，傳統(tǒng)的Northern Blot、RT-qPCR等方法只能研究個別基因。如今，高通量測序技術是研究轉錄組的絕對主流。

原核轉錄組學是打開原核生物生命活動“黑箱”的一把關鍵鑰匙。它使我們能夠從全局視角，動態(tài)地理解細菌如何生存、適應、致病和發(fā)揮作用。隨著測序技術的不斷進步和生物信息學分析方法的日益強大，原核轉錄組學將繼續(xù)在基礎研究、醫(yī)學、工業(yè)和環(huán)境科學等領域發(fā)揮不可替代的作用。

原核轉錄組的獨特特征

與原核生物的特殊細胞結構（無核膜）和基因結構密切相關，其轉錄組具有一些鮮明特點：

基因排列緊湊：基因組中編碼區(qū)占比高，基因間隔區(qū)短，非編碼RNA和調控序列需要更精細的分析來識別。

缺乏內含子：基因中沒有內含子，因此轉錄后沒有RNA剪接過程，轉錄本結構相對簡單。

轉錄與翻譯偶聯(lián)：由于沒有核膜的物理分隔，mRNA在轉錄的同時就可以被核糖體結合開始翻譯，這使得mRNA的壽命通常很短（幾分鐘），轉錄組狀態(tài)變化非常迅速。

廣泛的調控RNA：存在大量sRNA，它們通過與靶標mRNA堿基配對來調控其穩(wěn)定性或翻譯效率，是轉錄后調控的核心。

多順反子mRNA：原核生物的一個mRNA分子通常包含多個功能相關的基因（一個操縱子），同時被轉錄和翻譯。這意味著一個啟動子的活性可以同時影響多個基因的表達。

產品優(yōu)勢

優(yōu)勢一

超高的RNA提取成功率：范本級樣品制備流程，樣本處理經驗豐富，實驗成功率高；

優(yōu)勢二

構建鏈特異性文庫，數(shù)據(jù)質量高，表達定量和結構分析更準確：采用鏈特異性建庫，承諾有效數(shù)據(jù)量，保證數(shù)據(jù)分析的可靠性；

優(yōu)勢三

分析內容豐富，除了基礎的mRNA分析，還增加了非編碼的分析，內容全面；

優(yōu)勢四

云分析，小工具操作簡便實用性強。

工作流程

  • 建庫測序

使用RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples（lexogen，USA）去除rRNA，將mRNA隨機斷裂成200bp左右的小片段，以mRNA為模板，利用隨機引物反轉錄合成雙鏈cDNA。在合成cDNA第二鏈時，用dUTP代替dTTP進行合成，合成的雙鏈cDNA加入End Repair Mix將其補成平末端，5’端磷酸化，3’末端加上一個A堿基，連接Y字形測序接頭。然后用UNG酶消除含有dUTP的cDNA第二鏈，從而使文庫中只包含cDNA的第一鏈。使用Illumina（San Diego，CA）的Illumina? Stranded mRNA Prep, Ligation進行RNA文庫構建。使用illumina測序儀（NovaSeq6000或其他新機型）進行RNA-seq雙端測序。

原核轉錄組測序流程
  • 分析流程

測序數(shù)據(jù)下機后，使用百邁客云平臺BMKCloud(www.biocloud.net)提供的生物信息學分析流程進行數(shù)據(jù)分析。將下機數(shù)據(jù)進行過濾得到Clean Data，與指定的參考基因組進行序列比對，隨后進行文庫質量評估、基因表達定量、差異表達分析、結構分析等。RNA-seq生物信息分析流程見下圖：

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工作流程

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送樣要求

原核轉錄組送樣要求

應用案例

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常見問題

1. 質檢不合格的最常見原因？

答：（1）核酸濃度或總量不足；（2）雜質污染；（3）核酸降解。

2. 完成圖 DNA 降解，質檢結果及是否滿足建庫標準？

答：

嚴重降解：無清晰主帶、條帶彌散、無法建庫。

中度降解：有清晰主帶、有適度拖尾，且有 5 kb 以下大小的拖尾片段。質檢判定為 C 不合格，可適用于風險建庫。

輕度降解：有清晰主帶、有輕度拖尾，且 5 kb 以下無拖尾片段?？山◣鞙y序。

3. 病原微生物樣品是否要做特殊處理？

答：對于病原微生物，建議老師送抽提好的 RNA 樣品，不建議接受病原微生物樣品。

4. 什么是 RIN 值？

答：RIN 值（RNA integrity number）通常代表著 RNA 質量的高低，從 0~10，值越大就說明 RNA 的質量越高，完整性越好。它是由 labchip GX 儀器檢測出來的。目前我們規(guī)定 RIN 值大于等于 4.5 的 RNA 樣品屬于合格樣品。

5. RIN 值不合格是不是一定說明樣品不合格？

答：不一定，對于一些特殊的樣品，它們的標準峰圖與典型的原核 RNA 峰圖不一致。因此，樣品檢測 RIN 值即使不合格，但如果無明顯降解、連續(xù)兩批樣品出現(xiàn)一致的情況，可認為是樣品的特殊性造成的，可用于建庫測序。

6.mapping比對率低怎么辦?

  • 參考基因組選擇不合適，此時建議重新查找正確的基因組。若實在沒有合適的參考基因組，建議改為無參進行后續(xù)分析；
  • 其他物種污染(如病菌)等，若是本物種病菌的污染，建議剔除該樣本；若是非本物種病菌的污染，建議聯(lián)系公司處理;
  • 樣品本身的問題(樣本前期質量不高、物種本身參考基因組不好、實驗處理為多個菌互作等)，此時若老師覺得跟自己的實驗需求一樣，則不需剔除樣本。若已經嚴重影響了后續(xù)實驗，建議剔除質量不高的樣本或者剔除病菌/病毒的序列。

7.樣本間重復性不好怎么處理?

  • 轉錄組的重復性是否好，是跟樣品有著非常密切的關系。首先要明確自己的實驗設計，如臨床樣本等， 由于個體之間差異巨大，可能本身就存在極大差異，若個體本身差異就大，有差異也是正常現(xiàn)象；
  • 從取樣方面及RNA抽提質檢方面考慮；
  • 轉錄組測序通常要求設置3個生物學重復樣本，如果樣本足夠多，建議比預期實驗設計多送1~2個樣本測序，以便后續(xù)某個樣品與組內其它樣本出現(xiàn)離群情況，直接剔除離群樣本，省時省力。若測序樣本較少，無法剔除樣本，也可以考慮對同一批次的備份樣本再次測序，后續(xù)再重新分析；
  • 體現(xiàn)轉錄組重復性好壞的有三個分析：PCA，距離熱圖以及表達量聚類熱圖。

8.分析到的差異基因數(shù)目偏少，如何解決?

  • 根據(jù)樣本重復性好壞(PCA和相關性熱圖)，建議客戶剔除異常樣本、重新分組后進行分析。
  • 若組內樣本重復性較好，但可能由于處理之間差異性本身就不明顯，可以通過調整參數(shù)（標準為：FDR≤0.05且|log2FC|≥1），通過降低差異基因的標準提高差異基因的個數(shù)，比如調整FDR為P-value，適當放寬差異倍數(shù)(將FC從2設置為1.5)，或者更換不同的分析軟件進行重新分析。