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CUT&Tag測序技術

Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 Transposase

產品介紹

CUT&Tag 是蛋白-DNA互作的一大革新技術，該技術核心為 Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 Transposase，該酶是將 Protein G/A 與經過工程學改造的超高活性 Tn5 轉座酶進行融合，形成同時具備轉座酶與 Protein G/A 活性的新型融合酶，專門適用于蛋白質-基因組互作研究的CUT&Tag 技術核心酶。

技術原理

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是一種可應用于表觀遺傳學領域的DNA-蛋白質互作研究新技術，主要用于研究轉錄因子或組蛋白修飾在全基因組上的結合或分布位點。

產品優(yōu)勢

細胞起始量低：可兼容低至60個細胞，甚至單細胞

超高活性：兼具pG/A &Tn5活性，DNA片段化活性極高

信噪比高：信噪比顯著優(yōu)于ChIP-Seq

實驗重復性好：平行樣本之間的重復性好

分析流程

送樣要求

1、獲取細胞樣品

A. 貼壁細胞 將貼壁細胞用移液器緩慢地吹/刮至懸浮狀，或采用胰酶或 EDTA 消化方法制備細胞懸液。B. 懸浮細胞 確定細胞生長狀態(tài)良好，細胞融合度達到 80%。

2、按照 50 萬個細胞每管進行分裝，準確標記后將分裝好的細胞 4℃、500G 離心 5min。（到公司后解凍， 由我們再挑選 10 萬個相對完整的細胞核進行實驗）

3、小心吸去全部上清，加入 500ul 冷 PBS 洗滌，4℃、500G 離心 5min。

4、小心吸去全部液體，加入 1ml 預冷的細胞凍存液，寬口槍頭輕輕吹打細胞沉淀混勻。管壁標記樣本名 稱。慢速梯度降溫凍存。

5、梯度降溫可參考：4 度 10min → 負 20 度 30min → 負 80 度過夜 → 液氮凍存。

6、將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入足量的干冰進行運輸。

7、為確保實驗的順利，建議樣品備份 1-2 份，50 萬個/份，以防部分樣品降解重新取材，制備或送樣。

結果展示

常見問題

CUT&Tag適用于什么物種？

CUT&Tag適用于哺乳動物細胞的蛋白-DNA互作研究，酵母、植物等細胞需要經過(破除細胞壁或者提取細胞核)來進行實驗。CUT&Tag在哺乳動物細胞系上的應用比較成熟，動物組織經過處理得到懸浮單個細胞同樣可以進行實驗。

CUT&Tag適用于活細胞，對細胞狀態(tài)有要求嗎？

CUT&Tag在活細胞上確實成功率比較高，在準備細胞時需要保證細胞處于高細胞活性狀態(tài)，若細胞活性不佳，胞內蛋白質與核酸相互作用的狀態(tài)會發(fā)生改變，對于死亡的細胞，目的蛋白有可能從染色質上脫落，進而影響實驗數(shù)據(jù)。在準備細胞樣本時使用臺盼藍進行細胞活性的檢測，建議細胞活力大于90%以上。

針對于Tn5切割開放染色質區(qū)域的特性，CUT&Tag是否更加適合于開放染色質區(qū)域的研究，異染色質上的位點是否適用？

CUT&Tag是ChIP-seq的替代技術，主要用于分析全基因組范圍內的DNA-蛋白質相互作用。容易將ATAC-seq技術與CUT&Tag技術混淆，CUT&Tag技術在異染色質位點上有很好的結果，Henikoff推薦的陽性對照就是存在于異染色質區(qū)域的H3K27me3，實驗數(shù)據(jù)顯示在H3K27me3上有很好的結果。

做ChIP-seq的時候不需要二抗，CUT&Tag二抗的作用是什么？二抗是必須的嗎？

ChIP-seq和CUT&Tag都可以研究基因組范圍內的DNA-蛋白質互相作用，但是這個是兩個完全不同的技術。ChIP-seq需要一抗與pA/pG 磁珠進行結合，釣取目的區(qū)域。CUT&Tag實驗中的二抗作用是放大信號，在豐度很高的靶蛋白不使用二抗也可以構建出CUT&Tag文庫，建議使用二抗。

做CUT&Tag實驗的時候，陰性對照和陽性對照怎么設置，IgG的陰性對照有意義么?

針對抗體的陽性對照可以采用RNA Pol II/ 組蛋白，證明系統(tǒng)沒有問題。陰性對照使用與一抗相同種屬的IgG，陽性對照，陰性對照證明抗體特異，實驗結果可信。

如何區(qū)分DNA提取步驟里提取到的目的區(qū)域和非目的區(qū)域？

被提取的DNA片段，只有加上了接頭的DNA片段才能在后續(xù)的PCR擴增中富集，通過PCR擴增可以特異性的富集目的片段。

對于 CUT&Tag 的實驗樣本，二代測序上機測序平臺如何選擇？

使用常規(guī)的PE150即可，主流的測序平臺如 HiSeq X10以及Novaseq均可。

抗體如何準備？

1）抗體（一抗和二抗）由客戶提供。

2）抗體（一抗和二抗）需要是原液，不要進行稀釋，每個樣本需要寄送 3ul 以上的原液。

3）抗體（一抗和二抗）需要嚴格按照抗體的說明書進行保存和運輸。

4）抗體（一抗和二抗）需說明書需要提前提交給百邁客，以方便安排后續(xù)實驗。

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