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原核鏈特異性轉(zhuǎn)錄組

基因表達(dá)精準(zhǔn)研究

原核鏈特異性轉(zhuǎn)錄組服務(wù)介紹

原核轉(zhuǎn)錄組指的是在特定時(shí)間、特定環(huán)境條件下，一個(gè)原核生物（如細(xì)菌、古菌）細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄本（RNA）的集合，傳統(tǒng)的Northern Blot、RT-qPCR等方法只能研究個(gè)別基因。如今，高通量測(cè)序技術(shù)是研究轉(zhuǎn)錄組的絕對(duì)主流。

原核轉(zhuǎn)錄組學(xué)是打開(kāi)原核生物生命活動(dòng)“黑箱”的一把關(guān)鍵鑰匙。它使我們能夠從全局視角，動(dòng)態(tài)地理解細(xì)菌如何生存、適應(yīng)、致病和發(fā)揮作用。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步和生物信息學(xué)分析方法的日益強(qiáng)大，原核轉(zhuǎn)錄組學(xué)將繼續(xù)在基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)、工業(yè)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮不可替代的作用。

原核轉(zhuǎn)錄組的獨(dú)特特征

與原核生物的特殊細(xì)胞結(jié)構(gòu)（無(wú)核膜）和基因結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，其轉(zhuǎn)錄組具有一些鮮明特點(diǎn)：

基因排列緊湊：基因組中編碼區(qū)占比高，基因間隔區(qū)短，非編碼RNA和調(diào)控序列需要更精細(xì)的分析來(lái)識(shí)別。

缺乏內(nèi)含子：基因中沒(méi)有內(nèi)含子，因此轉(zhuǎn)錄后沒(méi)有RNA剪接過(guò)程，轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。

轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)：由于沒(méi)有核膜的物理分隔，mRNA在轉(zhuǎn)錄的同時(shí)就可以被核糖體結(jié)合開(kāi)始翻譯，這使得mRNA的壽命通常很短（幾分鐘），轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)變化非常迅速。

廣泛的調(diào)控RNA：存在大量sRNA，它們通過(guò)與靶標(biāo)mRNA堿基配對(duì)來(lái)調(diào)控其穩(wěn)定性或翻譯效率，是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的核心。

多順?lè)醋觤RNA：原核生物的一個(gè)mRNA分子通常包含多個(gè)功能相關(guān)的基因（一個(gè)操縱子），同時(shí)被轉(zhuǎn)錄和翻譯。這意味著一個(gè)啟動(dòng)子的活性可以同時(shí)影響多個(gè)基因的表達(dá)。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

優(yōu)勢(shì)一

超高的RNA提取成功率：范本級(jí)樣品制備流程，樣本處理經(jīng)驗(yàn)豐富，實(shí)驗(yàn)成功率高；

優(yōu)勢(shì)二

構(gòu)建鏈特異性文庫(kù)，數(shù)據(jù)質(zhì)量高，表達(dá)定量和結(jié)構(gòu)分析更準(zhǔn)確：采用鏈特異性建庫(kù)，承諾有效數(shù)據(jù)量，保證數(shù)據(jù)分析的可靠性；

優(yōu)勢(shì)三

分析內(nèi)容豐富，除了基礎(chǔ)的mRNA分析，還增加了非編碼的分析，內(nèi)容全面；

優(yōu)勢(shì)四

云分析，小工具操作簡(jiǎn)便實(shí)用性強(qiáng)。

工作流程

  • 建庫(kù)測(cè)序

使用RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples（lexogen，USA）去除rRNA，將mRNA隨機(jī)斷裂成200bp左右的小片段，以mRNA為模板，利用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。在合成cDNA第二鏈時(shí)，用dUTP代替dTTP進(jìn)行合成，合成的雙鏈cDNA加入End Repair Mix將其補(bǔ)成平末端，5’端磷酸化，3’末端加上一個(gè)A堿基，連接Y字形測(cè)序接頭。然后用UNG酶消除含有dUTP的cDNA第二鏈，從而使文庫(kù)中只包含cDNA的第一鏈。使用Illumina（San Diego，CA）的Illumina? Stranded mRNA Prep, Ligation進(jìn)行RNA文庫(kù)構(gòu)建。使用illumina測(cè)序儀（NovaSeq6000或其他新機(jī)型）進(jìn)行RNA-seq雙端測(cè)序。

原核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程
  • 分析流程

測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)后，使用百邁客云平臺(tái)BMKCloud(www.biocloud.net)提供的生物信息學(xué)分析流程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。將下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾得到Clean Data，與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，隨后進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估、基因表達(dá)定量、差異表達(dá)分析、結(jié)構(gòu)分析等。RNA-seq生物信息分析流程見(jiàn)下圖：

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工作流程

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送樣要求

原核轉(zhuǎn)錄組送樣要求

應(yīng)用案例

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常見(jiàn)問(wèn)題

1. 質(zhì)檢不合格的最常見(jiàn)原因？

答：（1）核酸濃度或總量不足；（2）雜質(zhì)污染；（3）核酸降解。

2. 完成圖 DNA 降解，質(zhì)檢結(jié)果及是否滿(mǎn)足建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)？

答：

嚴(yán)重降解：無(wú)清晰主帶、條帶彌散、無(wú)法建庫(kù)。

中度降解：有清晰主帶、有適度拖尾，且有 5 kb 以下大小的拖尾片段。質(zhì)檢判定為 C 不合格，可適用于風(fēng)險(xiǎn)建庫(kù)。

輕度降解：有清晰主帶、有輕度拖尾，且 5 kb 以下無(wú)拖尾片段?？山◣?kù)測(cè)序。

3. 病原微生物樣品是否要做特殊處理？

答：對(duì)于病原微生物，建議老師送抽提好的 RNA 樣品，不建議接受病原微生物樣品。

4. 什么是 RIN 值？

答：RIN 值（RNA integrity number）通常代表著 RNA 質(zhì)量的高低，從 0~10，值越大就說(shuō)明 RNA 的質(zhì)量越高，完整性越好。它是由 labchip GX 儀器檢測(cè)出來(lái)的。目前我們規(guī)定 RIN 值大于等于 4.5 的 RNA 樣品屬于合格樣品。

5. RIN 值不合格是不是一定說(shuō)明樣品不合格？

答：不一定，對(duì)于一些特殊的樣品，它們的標(biāo)準(zhǔn)峰圖與典型的原核 RNA 峰圖不一致。因此，樣品檢測(cè) RIN 值即使不合格，但如果無(wú)明顯降解、連續(xù)兩批樣品出現(xiàn)一致的情況，可認(rèn)為是樣品的特殊性造成的，可用于建庫(kù)測(cè)序。

6.mapping比對(duì)率低怎么辦?

  • 參考基因組選擇不合適，此時(shí)建議重新查找正確的基因組。若實(shí)在沒(méi)有合適的參考基因組，建議改為無(wú)參進(jìn)行后續(xù)分析；
  • 其他物種污染(如病菌)等，若是本物種病菌的污染，建議剔除該樣本；若是非本物種病菌的污染，建議聯(lián)系公司處理;
  • 樣品本身的問(wèn)題(樣本前期質(zhì)量不高、物種本身參考基因組不好、實(shí)驗(yàn)處理為多個(gè)菌互作等)，此時(shí)若老師覺(jué)得跟自己的實(shí)驗(yàn)需求一樣，則不需剔除樣本。若已經(jīng)嚴(yán)重影響了后續(xù)實(shí)驗(yàn)，建議剔除質(zhì)量不高的樣本或者剔除病菌/病毒的序列。

7.樣本間重復(fù)性不好怎么處理?

  • 轉(zhuǎn)錄組的重復(fù)性是否好，是跟樣品有著非常密切的關(guān)系。首先要明確自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如臨床樣本等， 由于個(gè)體之間差異巨大，可能本身就存在極大差異，若個(gè)體本身差異就大，有差異也是正?，F(xiàn)象；
  • 從取樣方面及RNA抽提質(zhì)檢方面考慮；
  • 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序通常要求設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本，如果樣本足夠多，建議比預(yù)期實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)多送1~2個(gè)樣本測(cè)序，以便后續(xù)某個(gè)樣品與組內(nèi)其它樣本出現(xiàn)離群情況，直接剔除離群樣本，省時(shí)省力。若測(cè)序樣本較少，無(wú)法剔除樣本，也可以考慮對(duì)同一批次的備份樣本再次測(cè)序，后續(xù)再重新分析；
  • 體現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組重復(fù)性好壞的有三個(gè)分析：PCA，距離熱圖以及表達(dá)量聚類(lèi)熱圖。

8.分析到的差異基因數(shù)目偏少，如何解決?

  • 根據(jù)樣本重復(fù)性好壞(PCA和相關(guān)性熱圖)，建議客戶(hù)剔除異常樣本、重新分組后進(jìn)行分析。
  • 若組內(nèi)樣本重復(fù)性較好，但可能由于處理之間差異性本身就不明顯，可以通過(guò)調(diào)整參數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)為：FDR≤0.05且|log2FC|≥1），通過(guò)降低差異基因的標(biāo)準(zhǔn)提高差異基因的個(gè)數(shù)，比如調(diào)整FDR為P-value，適當(dāng)放寬差異倍數(shù)(將FC從2設(shè)置為1.5)，或者更換不同的分析軟件進(jìn)行重新分析。