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CUT&Tag測(cè)序技術(shù)

Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 Transposase

產(chǎn)品介紹

CUT&Tag 是蛋白-DNA互作的一大革新技術(shù)，該技術(shù)核心為 Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 Transposase，該酶是將 Protein G/A 與經(jīng)過工程學(xué)改造的超高活性 Tn5 轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行融合，形成同時(shí)具備轉(zhuǎn)座酶與 Protein G/A 活性的新型融合酶，專門適用于蛋白質(zhì)-基因組互作研究的CUT&Tag 技術(shù)核心酶。

技術(shù)原理

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是一種可應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的DNA-蛋白質(zhì)互作研究新技術(shù)，主要用于研究轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾在全基因組上的結(jié)合或分布位點(diǎn)。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

細(xì)胞起始量低：可兼容低至60個(gè)細(xì)胞，甚至單細(xì)胞

超高活性：兼具pG/A &Tn5活性，DNA片段化活性極高

信噪比高：信噪比顯著優(yōu)于ChIP-Seq

實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好：平行樣本之間的重復(fù)性好

分析流程

送樣要求

1、獲取細(xì)胞樣品

A. 貼壁細(xì)胞 將貼壁細(xì)胞用移液器緩慢地吹/刮至懸浮狀，或采用胰酶或 EDTA 消化方法制備細(xì)胞懸液。B. 懸浮細(xì)胞 確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞融合度達(dá)到 80%。

2、按照 50 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞每管進(jìn)行分裝，準(zhǔn)確標(biāo)記后將分裝好的細(xì)胞 4℃、500G 離心 5min。（到公司后解凍， 由我們?cè)偬暨x 10 萬(wàn)個(gè)相對(duì)完整的細(xì)胞核進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）

3、小心吸去全部上清，加入 500ul 冷 PBS 洗滌，4℃、500G 離心 5min。

4、小心吸去全部液體，加入 1ml 預(yù)冷的細(xì)胞凍存液，寬口槍頭輕輕吹打細(xì)胞沉淀混勻。管壁標(biāo)記樣本名 稱。慢速梯度降溫凍存。

5、梯度降溫可參考：4 度 10min → 負(fù) 20 度 30min → 負(fù) 80 度過夜 → 液氮凍存。

6、將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入足量的干冰進(jìn)行運(yùn)輸。

7、為確保實(shí)驗(yàn)的順利，建議樣品備份 1-2 份，50 萬(wàn)個(gè)/份，以防部分樣品降解重新取材，制備或送樣。

結(jié)果展示

常見問題

CUT&Tag適用于什么物種？

CUT&Tag適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白-DNA互作研究，酵母、植物等細(xì)胞需要經(jīng)過(破除細(xì)胞壁或者提取細(xì)胞核)來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CUT&Tag在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系上的應(yīng)用比較成熟，動(dòng)物組織經(jīng)過處理得到懸浮單個(gè)細(xì)胞同樣可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

CUT&Tag適用于活細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞狀態(tài)有要求嗎？

CUT&Tag在活細(xì)胞上確實(shí)成功率比較高，在準(zhǔn)備細(xì)胞時(shí)需要保證細(xì)胞處于高細(xì)胞活性狀態(tài)，若細(xì)胞活性不佳，胞內(nèi)蛋白質(zhì)與核酸相互作用的狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，對(duì)于死亡的細(xì)胞，目的蛋白有可能從染色質(zhì)上脫落，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在準(zhǔn)備細(xì)胞樣本時(shí)使用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞活性的檢測(cè)，建議細(xì)胞活力大于90%以上。

針對(duì)于Tn5切割開放染色質(zhì)區(qū)域的特性，CUT&Tag是否更加適合于開放染色質(zhì)區(qū)域的研究，異染色質(zhì)上的位點(diǎn)是否適用？

CUT&Tag是ChIP-seq的替代技術(shù)，主要用于分析全基因組范圍內(nèi)的DNA-蛋白質(zhì)相互作用。容易將ATAC-seq技術(shù)與CUT&Tag技術(shù)混淆，CUT&Tag技術(shù)在異染色質(zhì)位點(diǎn)上有很好的結(jié)果，Henikoff推薦的陽(yáng)性對(duì)照就是存在于異染色質(zhì)區(qū)域的H3K27me3，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示在H3K27me3上有很好的結(jié)果。

做ChIP-seq的時(shí)候不需要二抗，CUT&Tag二抗的作用是什么？二抗是必須的嗎？

ChIP-seq和CUT&Tag都可以研究基因組范圍內(nèi)的DNA-蛋白質(zhì)互相作用，但是這個(gè)是兩個(gè)完全不同的技術(shù)。ChIP-seq需要一抗與pA/pG 磁珠進(jìn)行結(jié)合，釣取目的區(qū)域。CUT&Tag實(shí)驗(yàn)中的二抗作用是放大信號(hào)，在豐度很高的靶蛋白不使用二抗也可以構(gòu)建出CUT&Tag文庫(kù)，建議使用二抗。

做CUT&Tag實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照怎么設(shè)置，IgG的陰性對(duì)照有意義么?

針對(duì)抗體的陽(yáng)性對(duì)照可以采用RNA Pol II/ 組蛋白，證明系統(tǒng)沒有問題。陰性對(duì)照使用與一抗相同種屬的IgG，陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照證明抗體特異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。

如何區(qū)分DNA提取步驟里提取到的目的區(qū)域和非目的區(qū)域？

被提取的DNA片段，只有加上了接頭的DNA片段才能在后續(xù)的PCR擴(kuò)增中富集，通過PCR擴(kuò)增可以特異性的富集目的片段。

對(duì)于 CUT&Tag 的實(shí)驗(yàn)樣本，二代測(cè)序上機(jī)測(cè)序平臺(tái)如何選擇？

使用常規(guī)的PE150即可，主流的測(cè)序平臺(tái)如 HiSeq X10以及Novaseq均可。

抗體如何準(zhǔn)備？

1）抗體（一抗和二抗）由客戶提供。

2）抗體（一抗和二抗）需要是原液，不要進(jìn)行稀釋，每個(gè)樣本需要寄送 3ul 以上的原液。

3）抗體（一抗和二抗）需要嚴(yán)格按照抗體的說明書進(jìn)行保存和運(yùn)輸。

4）抗體（一抗和二抗）需說明書需要提前提交給百邁客，以方便安排后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

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